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yixinyuan木虫 (正式写手)
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[求助]
实时荧光RT-PCR实验的相关问题
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| 想开展实时荧光RT-PCR实验，但是不知道要准备些什么器械和试剂，听说有试剂盒卖的，不知道哪种的好？还有试剂盒内有哪些成分，具体的操作步骤怎样，要注意哪些细节方面？ |
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 分子生物 |
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2楼2012-03-27 23:10:09
xiaoyugutou 
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3楼2012-03-27 23:20:59
atlanticwi
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【答案】应助回帖
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yixinyuan: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-03-28 20:52:52
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嗯............ 今天有好多童鞋问qPCR哦  1. 先确定你要准备做什么，是基因的表达分析，还是其他应用（我没有过其他方面应用，所以不清楚哦），这涉及到定量的两个应用分支：相对定量和绝对定量。 2. 确定你的分析方法，是SYBR Green I 法或TaqMan法，SYBR Green I 法通用性强，省钱省力，但致命弱点是其非特异结合所有双链核酸，可能造成假阳性结果，所以SYBR Green I 法需要从引物到模板任何方面下足功夫。TaqMan法木用过，虽然知道优缺点，但也不便多说咯。 3. 如果确定你要使用SYBR Green I 法，下边需要准备的是： （1）靠谱试剂公司的SYBR Green I Master Mix （2）和靠谱的一台定量PCR仪（用过一些qPCR仪，但最讨厌伯乐！！！，伯乐粉丝不要喷我......） 4. 不知你指的盒子是什么？我们都是直接买预混液的，Invitrogen、TOYOBO的都不错，主要看哪家打折狠........因为这个东西确实蛮贵的 5. qPCR注意细节众多，需要实践中一步步碰到再解决，刚开始就问这个，也不好解答.....抱歉 希望有所帮助 若有错，请高手指点 |
4楼2012-03-27 23:32:15
西瓜
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yixinyuan: 回帖置顶 2012-03-28 21:00:00
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楼主可看看这个资源，里面有很多定量PCR的知识： http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3234286&fpage=1 |
5楼2012-03-28 10:39:15
孙启亮
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【答案】应助回帖
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西瓜: 金币+2, 我们也用的Takara~这实验还是很贵的，楼主还是多准备下再上马。 2012-03-28 18:53:34
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首先，我觉得你要知道你们实验室以前做qPCR都是什么方法，是探针法还是染料法。 若是染料法，首先你得设计引物，设计方法同普通PCR的方法一样，染料法有缺点，对此楼上已经表述了。我们用的染料是takara的，便宜也比较好使。做荧光的话只需要买染料就可以了。 其次，楼主还得买提取RNA的试剂，RNase plus，也就是trizol，还有逆转录的试剂，逆转录酶啊，缓冲液了，等等，楼主可以去查这些试剂。 最后，希望楼主多了解下PCR原理，这样在以后的实验中可以少犯些错误，同时对自己以后遇到的困难也会着手解决，千万不能一眼抹黑的往前走 |
6楼2012-03-28 18:35:02
yixinyuan
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