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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助，为什么SSR扩增产物琼脂糖跑出的条带会比maker最大分子量还要大呢？？
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l20065091

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助，为什么SSR扩增产物琼脂糖跑出的条带会比maker最大分子量还要大呢？？

我做红藻微卫星标记的，先用温度梯度找到合适的退火温度后再进行PCR扩增的，引物来源有EST设计和同科属的不同物种，产物应该在500bp以下才对的哇？我maker用的DL1000的，琼脂糖为1%浓度，100V电泳30min，电泳后发现，PCR扩增出来的产物居然比maker最大分子量还要大，有的是同科属的不同物种的引物，这种情况不止一对引物出现，多对引物都出现，请问到底哪里出问题了？下面是我的PCR程序和体系，谢谢指教！！！
PCR程序：94度 5min  
                 94度50s
                 退火温度 45s
                 72度 50s 30个循环
          72度 8min
PCR体系25ul：Buffer 2.5ul
                       dntp 2ul
                      Mgcl2 1.5ul
                       F 0.8ul
                      R 0.8ul
                       Taq 0.3ul
                      加水至25ul

同一个科的近缘物种的引物扩增



本物种引物扩增
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1楼 2012-03-22 16:29:42
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kidluag

金虫 (正式写手)

不自信的师生

【答案】应助回帖

一般镁离子多了容易出杂带，但楼主的大分子量条带看亮度应该属于主带级别的，这种情况调整PCR体系或程序解决不了根本问题。具体问题在哪有待商榷，个人认为最大的问题可能还是出在引物上，因为楼主有说多对引物出现该问题，这就说明也有部分引物正常，同意楼上切胶回收测序的想法，也可用一个在大一些的marker先确认扩增条带的分子量再做进一步分析。不要片面的否认自己的结果。此外还有可能存在问题的就是你的DNA样品。
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被迫的无知小小博
6楼2013-05-26 01:33:04
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rommel1941

铁杆木虫 (正式写手)

情定山河

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励帮助解答问题！ 2012-03-22 18:37:37
建议继续优化试验条件，非特异扩增很严重，主要从Tm和Mg入手比较好。
我所做的SSR标记确实没出现过这种情况，你可以把比较亮的条带切胶回收，然后测序，看看是什么东东。
作微卫星不要这么长的退火时间和延长时间，一般控制在10-30s就好。我的试验条件是94度 4min；94度30s，退火温度 20s，72度 30s 30个循环；72度 2min。因为微卫星的长度都很小，太长的退火和延伸，可能会带来较强的非特异扩增。希望对你有帮助，祝好。
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l20065091
将相本无种★男儿当自强
2楼2012-03-22 16:47:14
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l20065091

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by rommel1941 at 2012-03-22 16:47:14:
建议继续优化试验条件，非特异扩增很严重，主要从Tm和Mg入手比较好。
我所做的SSR标记确实没出现过这种情况，你可以把比较亮的条带切胶回收，然后测序，看看是什么东东。
作微卫星不要这么长的退火时间和延长时 ...

Tm应该问题不是多大了，因为之前用温度梯度全部扩过，请问一下，您是做高等物种还是低等物种的呀？还有您觉得我这个体系的Mg是过高还是过低了？谢谢！！
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3楼2012-03-22 20:16:02
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rommel1941

铁杆木虫 (正式写手)

情定山河
1949stone: , 我也只做鸟类的 ssr很诡异的 2012-03-23 08:54:44
我做的是鸟类，你可以做个Mg离子的梯度。不过还是建议你回收测序，看看是什么东西，没准可以作为一个序列位点进行分析。
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将相本无种★男儿当自强
4楼2012-03-22 22:29:14
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