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求助，为什么SSR扩增产物琼脂糖跑出的条带会比maker最大分子量还要大呢？？
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我做红藻微卫星标记的，先用温度梯度找到合适的退火温度后再进行PCR扩增的，引物来源有EST设计和同科属的不同物种，产物应该在500bp以下才对的哇？我maker用的DL1000的，琼脂糖为1%浓度，100V电泳30min，电泳后发现，PCR扩增出来的产物居然比maker最大分子量还要大，有的是同科属的不同物种的引物，这种情况不止一对引物出现，多对引物都出现，请问到底哪里出问题了？下面是我的PCR程序和体系，谢谢指教！！！ PCR程序：94度 5min 94度50s 退火温度 45s 72度 50s 30个循环 72度 8min PCR体系25ul：Buffer 2.5ul dntp 2ul Mgcl2 1.5ul F 0.8ul R 0.8ul Taq 0.3ul 加水至25ul  同一个科的近缘物种的引物扩增  本物种引物扩增 |
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5楼2012-03-23 21:04:28
rommel1941
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励帮助解答问题！ 2012-03-22 18:37:37
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励帮助解答问题！ 2012-03-22 18:37:37
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建议继续优化试验条件，非特异扩增很严重，主要从Tm和Mg入手比较好。 我所做的SSR标记确实没出现过这种情况，你可以把比较亮的条带切胶回收，然后测序，看看是什么东东。 作微卫星不要这么长的退火时间和延长时间，一般控制在10-30s就好。我的试验条件是94度 4min；94度30s，退火温度 20s，72度 30s 30个循环；72度 2min。因为微卫星的长度都很小，太长的退火和延伸，可能会带来较强的非特异扩增。希望对你有帮助，祝好。 |
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l20065091
2楼2012-03-22 16:47:14
3楼2012-03-22 20:16:02
rommel1941
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4楼2012-03-22 22:29:14
