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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pET-28a原核不能表达目的蛋白
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lx19880717

金虫 (初入文坛)

[求助] pET-28a原核不能表达目的蛋白 已有2人参与

我在做原核表达的过程中，使用了pET-28a载体，Rosetta（DE3）表达菌株，但是37℃诱导表达后，连包涵体都没有看到，基本没有任何的蛋白表达，所以想请问一下大家，能不能帮我分析一下是什么原因？谢谢。
PS：我的目的蛋白大量重复序列，是否是由于重复序列导致蛋白在表达过程中无法折叠，如果是这个原因有什么办法可以解决，谢谢。
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1楼 2012-03-11 22:08:56
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任我逍遥江南

铜虫 (正式写手)
哈哈，这个我做多了，首先要确定你的克隆是没问题的。关于表达，每个蛋白的表达环境还是有一定差距的，诱导条件有一定的差距，主要是诱导前的细菌OD,一般在细菌的对数生长期，有的蛋白在OD 600为0.6时诱导效果最好，有的在1.0时诱导最好，看你是什么条件，

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14楼2016-04-03 16:08:28
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wszhyd

金虫 (初入文坛)
我也遇到楼主一样的问题，选用位点是Nco1 和Xho1 ，也是不表达，帮顶一下，希望高人指点一下。
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2楼2012-03-12 16:58:46
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lx19880717

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by wszhyd at 2012-03-12 16:58:46:
我也遇到楼主一样的问题，选用位点是Nco1 和Xho1 ，也是不表达，帮顶一下，希望高人指点一下。

呵呵，谢谢！
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3楼2012-03-12 20:33:16
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zhiqiang5070

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2012-03-14 22:15:48
我跟你一样，也是用的PET28a，不过我用的菌是BL21。
1.你先到上游看看，是不是载体构建的问题；菌p，提质粒酶切，测序看看。
2.上游没问题的话，改变诱导条件试试，T7lac启动子用IPTG1mM诱导6小时看看；
3你的菌有没有问题，可以把构建的重组载体提出来转化到新的感受态试试，我的问题就是这么解决滴
4.换高浓度胶跑跑看看，高浓度提高分辨率。
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无善无恶心之体
4楼2012-03-14 17:49:04
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