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如何做三段连接
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| 手头上有两个PCR片段和一个载体，酶切位点都合适，想做三段酶切连接。求有经验的人给予些实验指导和实验注意事项。不甚感激！ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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srlee
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good！果断EPI！ 2012-03-11 16:36:02
liuwei78(金币+3): 2012-03-12 19:58:09
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西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good！果断EPI！ 2012-03-11 16:36:02
liuwei78(金币+3): 2012-03-12 19:58:09
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又是连接问题，不过你的问题好像没有说清楚，别人给不了你具体的建议呀！ 1）“酶切位点都合适”是指你设计引物时添加的合适的酶切位点吗？ 2）你连接的载体多大？你要连接的两个片段分别又是多大？ 具体实验操作： 1）你可以先一个载体和一个片段连接验证后，再连第二个片段，这个方法就是一般的连接操作了。 2）你也可以将两个片段和载体一起加入到连接体系里连接，这个方法存在连接效率不高的问题，主要看你的片段大小和设计的酶切位点啦！ 3）你也可以用overlap PCR先把两个片段连起来，然后再和载体连接，具体操作看你后续试验要做什么了！ 祝实验顺利！ |
2楼2012-03-11 15:17:35