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wkl1984金虫 (小有名气)
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如何将下面的序列连接在一起？
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下面给出上下游引物的序列和连接子序列，大家帮忙分析一下如何将这三段片段连接在一起，组成共同的一段片段？ VH上游游引物：CCT CCA CCA CTC GAG ACG ACG ACT TCA ACG CCT GG VH 下游引物：GTA TAC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG GWG AAG CTG GTG GAG TCY GG 连接子：GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGT TCT GGC GGT GGC GGA TCG Vk上游引物：GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAK YTC CAG CTT GGT CCC VK下游引物：ACC GCC TCC ACC AGT GCA CTT GCC ATY GTG CTG ACC CAG AST CC 兼并碱基代码：Y=C/T R=A/G S=C/G W=A/T K=T/G 是直接将着3段片段放在同一PCR反应体系中，按照模板对待，还是先将VK和连接子进行PCR扩增后，再与VH进行PCR拼接？该如何操作呢？扩增的引物如何选择呢？ |
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yabxxh
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2楼2011-05-08 08:44:09
wkl1984
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3楼2011-05-08 12:18:24
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4楼2011-05-08 15:04:48
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5楼2011-05-08 20:09:00
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
看天(金币+5, EPI+1): 2011-05-09 12:40:43
看天(金币+5, EPI+1): 2011-05-09 12:40:43
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呵呵，这个我明白了，你是想用简并引物pCR出来两段片段，然后用分别和这两段片段的重合部分的连接子将这三段片段拼接成一条片段。 这个我前一段正好做过一个，不过你这样表述是不正确的，因为你的引物里面仍然是简并引物，虽然说简并引物一个位置可以悬挂不同的碱基，但是经过PCR之后，就是确定的碱基，即A、T、C、G中的一种。 所以我建议你把获得的片段测序之后，确定了到底是什么碱基，再来重新设计一个连接子，因为你现在的连接子无论和前面的片段还是和后面的片段都没有重叠部分可言。 等你测完序，重新设计了连接子之后，就简单了，用vh的上游引物和连接子pcr，用连接子和vk的下游引物PCR，然后将获得的两个片段互相退火之后，用vh的上游引物和vk的下游引物做一个普通PCR就可以了。 好运。 |
6楼2011-05-09 09:34:41
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7楼2011-05-10 11:00:44
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8楼2011-05-10 11:33:38
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9楼2011-05-10 13:03:18