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yabxxh

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
看天(金币+5, EPI+1): 2011-05-09 12:40:43

引用回帖:

Originally posted by wkl1984 at 2011-05-08 12:18:24:
就是将 VK链的上游引物和连接子之间有重复序列，连接子与VH链的下游引物之间有重叠区，我现在不知道怎样将这3段组成一个整体？

呵呵，这个我明白了，你是想用简并引物pCR出来两段片段，然后用分别和这两段片段的重合部分的连接子将这三段片段拼接成一条片段。
这个我前一段正好做过一个，不过你这样表述是不正确的，因为你的引物里面仍然是简并引物，虽然说简并引物一个位置可以悬挂不同的碱基，但是经过PCR之后，就是确定的碱基，即A、T、C、G中的一种。
所以我建议你把获得的片段测序之后，确定了到底是什么碱基，再来重新设计一个连接子，因为你现在的连接子无论和前面的片段还是和后面的片段都没有重叠部分可言。
等你测完序，重新设计了连接子之后，就简单了，用vh的上游引物和连接子pcr，用连接子和vk的下游引物PCR，然后将获得的两个片段互相退火之后，用vh的上游引物和vk的下游引物做一个普通PCR就可以了。
好运。

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6楼2011-05-09 09:34:41

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