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landscape37新虫 (小有名气)
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原核表达IPTG诱导后样品处理
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有几个问题搞不清楚，请高手给点经验 1.IPTG诱导后的2,4,6..小时后还需要测OD吗？那要保证上样量一致来看哪个时期蛋白表达量最高，是根据取相同菌液，离心，然后加相同细胞裂解液，取相同量跑电泳吗？要等一起处理样品的话，如何保存呢？ 2.关于周质空间的分离：我的载体有信号肽，所以我想分离周质空间跑电泳，看我的蛋白表达情况，有一个protocol裂解液直接用200mM Tris-HCL+20%蔗糖，pH8.0（菌液离心，裂解液重悬沉淀，注意用枪头吹打，不能涡旋，置于冰上1个小时，其间shake几次，然后4度15000g离心30min，取上清即得周质部分）。 但是我看其他很多细胞裂解液都是要有破裂细胞壁的EDTA还有溶菌酶，才能得到周质空间，上面的做法可行吗？我参照的下面是另外一个普通的protocol： [3].取菌液离心，转移上清，上清液中加入等体积冰浴冷的10% TCA，冰上放置20min，高速离心后弃上清，用1ml甲醇洗涤沉淀2次，标记为A，即菌液部分。 [4].在细菌沉淀中加入100μl 细胞裂解液重悬细菌，置冰上10min。 [5].高速离心后移出上清液，将上清液标记为B，即周质部分。 [6].在沉淀中加入100μl 0.1mM Tris-HCl (pH8.0)重悬沉淀，经干冰和37℃水浴反复冻溶3次，高速离心后移出上清液，将上清液标记为C，可溶性胞质部分。 [7].在沉淀中加入100μl 0.1M Tris-HCl (pH8.0)重悬沉淀，标记为D，即包涵体部分。 ps：我觉得第六步中的0.1mM Tris-HCL浓度是不是太低了，应该是0.1M吧？ |
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