| 查看: 1822 | 回复: 2 | |||
landscape37新虫 (小有名气)
|
[求助]
原核表达IPTG诱导后样品处理
|
|
有几个问题搞不清楚，请高手给点经验 1.IPTG诱导后的2,4,6..小时后还需要测OD吗？那要保证上样量一致来看哪个时期蛋白表达量最高，是根据取相同菌液，离心，然后加相同细胞裂解液，取相同量跑电泳吗？要等一起处理样品的话，如何保存呢？ 2.关于周质空间的分离：我的载体有信号肽，所以我想分离周质空间跑电泳，看我的蛋白表达情况，有一个protocol裂解液直接用200mM Tris-HCL+20%蔗糖，pH8.0（菌液离心，裂解液重悬沉淀，注意用枪头吹打，不能涡旋，置于冰上1个小时，其间shake几次，然后4度15000g离心30min，取上清即得周质部分）。 但是我看其他很多细胞裂解液都是要有破裂细胞壁的EDTA还有溶菌酶，才能得到周质空间，上面的做法可行吗？我参照的下面是另外一个普通的protocol： [3].取菌液离心，转移上清，上清液中加入等体积冰浴冷的10% TCA，冰上放置20min，高速离心后弃上清，用1ml甲醇洗涤沉淀2次，标记为A，即菌液部分。 [4].在细菌沉淀中加入100μl 细胞裂解液重悬细菌，置冰上10min。 [5].高速离心后移出上清液，将上清液标记为B，即周质部分。 [6].在沉淀中加入100μl 0.1mM Tris-HCl (pH8.0)重悬沉淀，经干冰和37℃水浴反复冻溶3次，高速离心后移出上清液，将上清液标记为C，可溶性胞质部分。 [7].在沉淀中加入100μl 0.1M Tris-HCl (pH8.0)重悬沉淀，标记为D，即包涵体部分。 ps：我觉得第六步中的0.1mM Tris-HCL浓度是不是太低了，应该是0.1M吧？ |
回复此楼» 猜你喜欢
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有262人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
-
留学--博士招生
已经有13人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- T7载体的IPTG诱导
已经有10人回复
- IPTG诱导后，考染后什么蛋白条带都没有
已经有12人回复
- IPTG诱导表达出现两条带，并离的很近，什么原因啊？
已经有6人回复
- 关于原核表达中，IPTG,KAN等的配制和最终工作浓度问题！！！
已经有16人回复
- IPTG诱导
已经有15人回复
- 【求助/交流】大肠杆菌工程菌不经过IPTG诱导能否大量表达
已经有3人回复
- 【求助/交流】原核表达 诱导时间的长短影不影响蛋白的活性啊？
已经有6人回复
- 【求助/交流】十万火急，IPTG诱导是怎么回事，给我说个大概
已经有9人回复
- 【求助/交流】原核pET系统低温诱导表达菌体浓度太小怎么办？
已经有7人回复
landscape37
新虫 (小有名气)
 |
2楼2012-03-12 13:10:24
3楼2012-03-12 19:59:37
20