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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请教有关提取人肝脏组织RNA提取的技术
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liumangtu403

铁虫 (小有名气)

[求助] 请教有关提取人肝脏组织RNA提取的技术已有3人参与

各位高手，本菜鸟提取肝组织RNA大半个月仍未能成功，跪求各位高手帮助，感激涕零！
我将组织放在研钵中液氮研磨， 将组织研磨到粉末后加1ml trizol到研钵中，继续研磨成粉末后放入超净台中等待融化，之后将液体吸入EP管进行RNA提取。说明书上提到1ml TRIZOL可以溶解50——100mg组织，但我加入50mg组织后产生大量沉淀，且液体呈现黑色，似乎无法溶完这么多组织，且后续电泳表明RNA降解，而加入较少的组织(10mg左右)提取的RNA又很少，估计只有几微克，浓度太低无法使用。想请问各位高手，肝组织是RNA含量较高的组织，为何我研磨的很细了还是提不出足够量的RNA？1mlTRIZOL应溶解多少mg组织合适？
   另外列上后面的RNA提取步骤，请各位高手指正：
                        1、TRIZOL移入EP管后，吹打混匀（我们实验室没有匀浆机，只能将粉末研磨到足够细）
                         2、12000rmp离心10分钟离去不溶物（省略该部是否会影响RNA得率？）
                         3、室温放置10min, 加入氯仿200ul/每管，剧烈震荡15s,冰上放置5min(有网友提到要放置15min,但我放置15min后离心上层呈现淡黄色，蛋白层变薄，不知有没有问题)
                        4、取上清（上清的液体量多是否表明RNA得量多？）
                        5、500ul 异丙醇沉淀，冰置10min,12000rmp离心10min.
                       6、1ml 75%乙醇洗一遍，12000rmp 离心5min
                        7、超净台晾干5min,加入Rnase-free 水
急盼各位高手回复 ，谢谢！
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1楼2012-03-02 20:13:56
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dodou

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

建议你用2ml的管子提取，加60mg的样品 记住，不得多啊 ，1.5ml的Trizol，剧烈震荡，离心取上清则按照原来的步骤继续就可以!
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2楼2012-08-14 18:25:00
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可怜我的生活

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

要不要试一试，先加入trizol，然后加入液氮，在进行研磨？我也没有具体的做过这个实验，
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3楼2018-10-21 20:18:55
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实验加油

禁言 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
4楼2018-12-10 10:52:23
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宇宙小妖怪

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

用Trizol能提RNA的，个人比觉得还要需要从提量下手，我们实验室用BIODAI离心提取法单次处理的样本量可以达到1000μL，楼主需要注意用Trizol每个步骤操作要快，用的时间药短些，防止RNA降解,异丙醇沉淀的时候，放-20°C的冰箱半个小时，或再适当延长一点时间。迅速离心，之后加75%乙醇。只洗一遍，洗2遍易损失部分RNA。不要过分干燥，管内稍有点残余的乙醇也没关系。干燥一会就迅速加DEPC水少量。提取RNA之后迅速反转录成cDNA再保存。
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5楼2019-03-11 09:03:09
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