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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » overlap PCR之问题
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tyw2623

金虫 (小有名气)

[交流] overlap PCR之问题

各位，我最近在连基因A（700bp左右）和基因B（700bp左右），重叠的连个引物为48bp，连个基因各占24bp。当做重叠PCR时，在1400bp处有条带（在我用的marker-D 1000bp和2000bp间的条带）当然也有其他的杂带。我将此1400bp的带回收后，以此为模板，用头尾引物扩增，每次都是1400bp处条带很暗，而在700bp处条带很亮。我用回收的1400bp做模板时，分别扩基因A和基因B却又能扩出来很明显的A和B，这不是证明了我回收的1400bp为连接上的基因吗  ，可为什么用头尾引物扩1400本身却扩不出来呢？
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1楼 2012-02-27 19:52:05
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tyw2623

金虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by fwks3518 at 2012-02-28 09:14:14:
二次PCR用原来的两端引物扩增，P不出来的现象很普遍，几乎每个人都遇到过。如果需要大量的PCR产物的话，第一次就平行多扩增几管，不要二次PCR

但我还是搞不明白  这是为什么    明明是那个东西   怎么就p不出来
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9楼2012-02-28 09:52:52
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tyw2623

金虫 (小有名气)
1        ATGGTCAGCT ACTGGGACAC CGGGGTCCTG CTGTGCGCGC TGCTCAGCTG TCTGCTTCTC ACAGGATCTA GTTCAGGTAG TGATACAGGT AGACCTTTCG
        TACCAGTCGA TGACCCTGTG GCCCCAGGAC GACACGCGCG ACGAGTCGAC AGACGAAGAG TGTCCTAGAT CAAGTCCATC ACTATGTCCA TCTGGAAAGC
      101        TAGAGATGTA CAGTGAAATC CCCGAAATTA TACACATGAC TGAAGGAAGG GAGCTCGTCA TTCCCTGCCG GGTTACGTCA CCTAACATCA CTGTTACTTT
        ATCTCTACAT GTCACTTTAG GGGCTTTAAT ATGTGTACTG ACTTCCTTCC CTCGAGCAGT AAGGGACGGC CCAATGCAGT GGATTGTAGT GACAATGAAA
      201        AAAAAAGTTT CCACTTGACA CTTTGATCCC TGATGGAAAA CGCATAATCT GGGACAGTAG AAAGGGCTTC ATCATATCAA ATGCAACGTA CAAAGAAATA
        TTTTTTCAAA GGTGAACTGT GAAACTAGGG ACTACCTTTT GCGTATTAGA CCCTGTCATC TTTCCCGAAG TAGTATAGTT TACGTTGCAT GTTTCTTTAT
      301        GGGCTTCTGA CCTGTGAAGC AACAGTCAAT GGGCATTTGT ATAAGACAAA CTATCTCACA CATCGACAAA CCAATACAAT CATAGATGTG GTTCTGAGTC
        CCCGAAGACT GGACACTTCG TTGTCAGTTA CCCGTAAACA TATTCTGTTT GATAGAGTGT GTAGCTGTTT GGTTATGTTA GTATCTACAC CAAGACTCAG
      401        CGTCTCATGG AATTGAACTA TCTGTTGGAG AAAAGCTTGT CTTAAATTGT ACAGCAAGAA CTGAACTAAA TGTGGGGATT GACTTCAACT GGGAATACCC
        GCAGAGTACC TTAACTTGAT AGACAACCTC TTTTCGAACA GAATTTAACA TGTCGTTCTT GACTTGATTT ACACCCCTAA CTGAAGTTGA CCCTTATGGG
      501        TTCTTCGAAG CATCAGCATA AGAAACTTGT AAACCGAGAC CTAAAAACCC AGTCTGGGAG TGAGATGAAG AAATTTTTGA GCACCTTAAC TATAGATGGT
        AAGAAGCTTC GTAGTCGTAT TCTTTGAACA TTTGGCTCTG GATTTTTGGG TCAGACCCTC ACTCTACTTC TTTAAAAACT CGTGGAATTG ATATCTACCA
      601        GTAACCCGGA GTGACCAAGG ATTGTACACC TGTGCAGCAT CCAGTGGGCT GATGACCAAG AAGAACAGCA CATTTGTCAG GGTCCATGAA AAA
        CATTGGGCCT CACTGGTTCC TAACATGTGG ACACGTCGTA GGTCACCCGA CTACTGGTTC TTCTTGTCGT GTAAACAGTC CCAGGTACTT TTT
基因A
1        GACAAAACTC ACACATGCCC ACCGTGCCCA GCACCTGAAC TCCTGGGGGG ACCGTCAGTC TTCCTCTTCC CCCCAAAACC CAAGGACACC CTCATGATCT
        CTGTTTTGAG TGTGTACGGG TGGCACGGGT CGTGGACTTG AGGACCCCCC TGGCAGTCAG AAGGAGAAGG GGGGTTTTGG GTTCCTGTGG GAGTACTAGA
      101        CCCGGACCCC TGAGGTCACA TGCGTGGTGG TGGACGTGAG CCACGAAGAC CCTGAGGTCA AGTTCAACTG GTACGTGGAC GGCGTGGAGG TGCATAATGC
        GGGCCTGGGG ACTCCAGTGT ACGCACCACC ACCTGCACTC GGTGCTTCTG GGACTCCAGT TCAAGTTGAC CATGCACCTG CCGCACCTCC ACGTATTACG
      201        CAAGACAAAG CCGCGGGAGG AGCAGTACAA CAGCACGTAC CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC CAGGACTGGC TGAATGGCAA GGAGTACAAG
        GTTCTGTTTC GGCGCCCTCC TCGTCATGTT GTCGTGCATG GCACACCAGT CGCAGGAGTG GCAGGACGTG GTCCTGACCG ACTTACCGTT CCTCATGTTC
      301        TGCAAGGTCT CCAACAAAGC CCTCCCAGCC CCCATCGAGA AAACCATCTC CAAAGCCAAA GGGCAGCCCC GAGAACCACA GGTGTACACC CTGCCCCCAT
        ACGTTCCAGA GGTTGTTTCG GGAGGGTCGG GGGTAGCTCT TTTGGTAGAG GTTTCGGTTT CCCGTCGGGG CTCTTGGTGT CCACATGTGG GACGGGGGTA
      401        CCCGGGATGA GCTGACCAAG AACCAGGTCA GCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTATC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC
        GGGCCCTACT CGACTGGTTC TTGGTCCAGT CGGACTGGAC GGACCAGTTT CCGAAGATAG GGTCGCTGTA GCGGCACCTC ACCCTCTCGT TACCCGTCGG
      501        GGAGAACAAC TACAAGACCA CGCCTCCCGT GCTGGACTCC GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAAGCTC ACCGTGGACA AGAGCAGGTG GCAGCAGGGG
        CCTCTTGTTG ATGTTCTGGT GCGGAGGGCA CGACCTGAGG CTGCCGAGGA AGAAGGAGAT GTCGTTCGAG TGGCACCTGT TCTCGTCCAC CGTCGTCCCC
      601        AACGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG GCTCTGCACA ACCACTACAC GCAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCCGGGTAA ATGA
        TTGCAGAAGA GTACGAGGCA CTACGTACTC CGAGACGTGT TGGTGATGTG CGTCTTCTCG GAGAGGGACA GAGGCCCATT TACT
基因B
P1：5'GCTCTAGAATGGTCAGCTACTGGGACAC3'  
P2：5'GGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCTTTTTCATGGACCCTGACAAATGTG3'
P3：5'CACATTTGTCAGGGTCCATGAAAAAGACAAAACTCACACATGCCCACC3'   
p4:5'GAGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGG3'
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2楼2012-02-27 19:56:30
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tyw2623

金虫 (小有名气)
基因A和基因B我写的都是双链
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3楼2012-02-27 19:57:18
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fwks3518

木虫 (正式写手)
★
tyw2623(金币+1):谢谢参与
二次PCR用原来的两端引物扩增，P不出来的现象很普遍，几乎每个人都遇到过。如果需要大量的PCR产物的话，第一次就平行多扩增几管，不要二次PCR
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4楼2012-02-28 09:14:14
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