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yang_j2011新虫 (初入文坛)
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关于毕赤酵母电转化 已有1人参与
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下面是我的实验方案和步骤： 方案： （1）构建重组质粒pGAPZaA-pbd-1：载体：pGAPZaA 目的基因：pbd-1 (2) 线性化： 用Bln1酶切重组质粒pGAPZaA-pbd-1； （3）制备酵母电击转化感受态： （1）.从-70度酵母的保藏菌种SMD1168在YPD平板上划线后，放置于30度恒温培养箱中培养3天后，挑取单个菌落，接种于2ml YPD培养基中，225r/min，30℃震荡培养8h。 （2）.取100μl菌液接种于含10ml YPD培养基的培养瓶中，用15 ml离心管摇，5 ml 一管，225r/min，30℃震荡培养过夜。监测OD600，待其达到1.3～1.5时，（3）吸取菌液分装于8个1.5 ml离心管中，每管1.25 ml，,置于冰上，放置10min，使培养物冷却至0℃。4℃，4000rpm离心5min收集细胞。倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。 （4）.用1ml预冷过的灭菌水重悬细胞沉淀，4℃，4000rpm，离心5min。 （5）用1ml预冷过的灭菌水重悬细胞沉淀，4℃，4000rpm，离心5min。 （6）用500ul预冷过的1M D-山梨醇重悬细胞沉淀，4℃,4000rpm，离心5min。用250ul预冷过的1M D-山梨醇重悬细胞沉淀，4℃,4000rpm，离心5min。 （7）.用25μl预冷过的1mol/L D-山梨醇重悬细胞沉淀，轻轻旋转混匀，4管悬浮菌液合并一管100μl分装于1.5 ml离心管中，置于冰上，当天使用，用于酵母电转化。 （4）电击转化感受态SMD1168 酵母电转化步骤如下： （1）把电转化杯从75%的酒精中拿出，超净台风干，同时紫外照射20分钟，只后把转化杯放入冰盒预冷。 （2）取80μl上述感受态菌，与5～10μg线性化的重组表达质粒混合，移入0.2cm电转化杯，冰浴5min。 （3）擦干水汽，置电转仪上，选择酵母参数（电击参数：1500V，200V，25μF)电转化。 （4）电击后立即加入1ml冰浴的1mol/L山梨醇，转入15ml离心管中，30度静置1h,然后加入2mlYPD培养基30度摇菌3h。 （5）低速离心后涂板（YPDS+Zeocin100ug/ml） 结果： 板上一个也不长，后来降低了抗生素的浓度到50ug/ml，结果长了，但没有转化过的对照也长，拿长出来的菌做发酵没有表达产物。 重组质粒经测序结果正确，没有移码突变，会不会是感受态做法有问题，感受态的效率太低了？ 恳请老师指导一下。谢谢！ |
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 小Poo |
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yang_j2011
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yang_j2011
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