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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于毕赤酵母电转化
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yang_j2011

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于毕赤酵母电转化 已有1人参与

下面是我的实验方案和步骤：

方案：

（1）构建重组质粒pGAPZaA-pbd-1：载体：pGAPZaA 目的基因：pbd-1

   (2) 线性化：  用Bln1酶切重组质粒pGAPZaA-pbd-1；

（3）制备酵母电击转化感受态：
（1）.从-70度酵母的保藏菌种SMD1168在YPD平板上划线后，放置于30度恒温培养箱中培养3天后，挑取单个菌落，接种于2ml YPD培养基中，225r/min，30℃震荡培养8h。

（2）.取100μl菌液接种于含10ml YPD培养基的培养瓶中，用15 ml离心管摇，5 ml 一管，225r/min，30℃震荡培养过夜。监测OD600，待其达到1.3～1.5时，（3）吸取菌液分装于8个1.5 ml离心管中，每管1.25 ml，,置于冰上，放置10min，使培养物冷却至0℃。4℃，4000rpm离心5min收集细胞。倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。

（4）.用1ml预冷过的灭菌水重悬细胞沉淀，4℃，4000rpm，离心5min。

（5）用1ml预冷过的灭菌水重悬细胞沉淀，4℃，4000rpm，离心5min。

（6）用500ul预冷过的1M D-山梨醇重悬细胞沉淀，4℃,4000rpm，离心5min。用250ul预冷过的1M D-山梨醇重悬细胞沉淀，4℃,4000rpm，离心5min。

（7）.用25μl预冷过的1mol/L D-山梨醇重悬细胞沉淀，轻轻旋转混匀，4管悬浮菌液合并一管100μl分装于1.5 ml离心管中，置于冰上，当天使用，用于酵母电转化。

（4）电击转化感受态SMD1168

酵母电转化步骤如下：

（1）把电转化杯从75%的酒精中拿出，超净台风干，同时紫外照射20分钟，只后把转化杯放入冰盒预冷。

（2）取80μl上述感受态菌，与5～10μg线性化的重组表达质粒混合，移入0.2cm电转化杯，冰浴5min。

（3）擦干水汽，置电转仪上，选择酵母参数（电击参数：1500V，200V，25μF)电转化。

（4）电击后立即加入1ml冰浴的1mol/L山梨醇，转入15ml离心管中，30度静置1h,然后加入2mlYPD培养基30度摇菌3h。

（5）低速离心后涂板（YPDS+Zeocin100ug/ml）

结果：

    板上一个也不长，后来降低了抗生素的浓度到50ug/ml，结果长了，但没有转化过的对照也长，拿长出来的菌做发酵没有表达产物。

    重组质粒经测序结果正确，没有移码突变，会不会是感受态做法有问题，感受态的效率太低了？

   恳请老师指导一下。谢谢！
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1楼 2012-02-21 14:21:45
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Petter_JDW

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 鼓励应助 2012-02-21 17:26:33
我们实验室做酵母感受态是无菌水洗过后 加入25 mM的DTT悬浮，冰浴10min后用预冷过的1M D-山梨醇重悬细胞，洗一两遍，后面一样；
还有我看你把载体线性化以后转酵母有点像REMI法~你试试转化时 取80μl上述感受态菌，与5～10μg线性化的重组表达质粒再加入10U左右的Bln1酶混合，移入0.2cm电转化杯，冰浴5min。可能会提高载体插入基因组效率~
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2楼2012-02-21 14:34:09
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龙眼宝贝

新虫 (初入文坛)
菌液（100μl）：培养液（10ml）这个比例太大了吧，我看invitrogen上毕赤酵母的说明书，人家是0.1~0.5ml菌液：500ml培养基，而且你拿离心管来摇菌，氧气问题是否考虑。需要考虑培养液体积与培养瓶体积的比例。
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9楼2013-11-18 15:09:04
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小丹木木

荣誉版主 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看过程好像和我们做GS115感受态没什么区别啊，电转杯我们是泡在无水乙醇中的，还有就是电转条件，我们好像用的2500V，电阻忘了，电容一样。是不是把电转条件改一下啊。是不是电压太低，没转进去啊？
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3楼2012-02-21 17:32:56
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yang_j2011

新虫 (初入文坛)
可能是电转杯的问题，我量了一下，我用的是1mm的电转杯，容量是100ul，电压我用的是1500V，会不会是这有问题？
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4楼2012-02-23 13:22:57
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yang_j2011

新虫 (初入文坛)
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楼: Originally posted by 小丹木木 at 2012-02-21 17:32:56:
看过程好像和我们做GS115感受态没什么区别啊，电转杯我们是泡在无水乙醇中的，还有就是电转条件，我们好像用的2500V，电阻忘了，电容一样。是不是把电转条件改一下啊。是不是电压太低，没转进去啊？

可能是电转杯的问题，我量了一下，我用的是1mm的电转杯，容量是100ul，电压我用的是1500V，会不会是这有问题？
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5楼2012-02-23 13:23:59
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小丹木木

荣誉版主 (著名写手)
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5楼: Originally posted by yang_j2011 at 2012-02-23 13:23:59:
可能是电转杯的问题，我量了一下，我用的是1mm的电转杯，容量是100ul，电压我用的是1500V，会不会是这有问题？

肯定有问题了，电转杯选择如下：

和场强有关系的，你选现在的电压的话，电阻就要变。
我用的0.2cm的，电压是2500，电阻不记得了，但是持续时间是5ms左右，电转效果最好。你可以自己再查查。

[ Last edited by 小丹木木 on 2012-2-23 at 13:47 ]
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6楼2012-02-23 13:40:03
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yang_j2011

新虫 (初入文坛)
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楼: Originally posted by 小丹木木 at 2012-02-23 13:40:03:
肯定有问题了，电转杯选择如下：

和场强有关系的，你选现在的电压的话，电阻就要变。
我用的0.2cm的，电压是2500，电阻不记得了，但是持续时间是5ms左右 ...

师姐有没有用过Zeocin 这个抗生素呀，昨天做的没有转化的对照板上也长了好多,抗生素浓度是100ug/ml，我涂的菌有点浓，好几次都这样，不知道怎么回事
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7楼2012-02-29 12:47:26
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小丹木木

荣誉版主 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by yang_j2011 at 2012-02-29 12:47:26:
师姐有没有用过Zeocin 这个抗生素呀，昨天做的没有转化的对照板上也长了好多,抗生素浓度是100ug/ml，我涂的菌有点浓，好几次都这样，不知道怎么回事

我没有用这个了，
没有转化的板上也长了，明显是抗生素有问题啊
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8楼2012-02-29 13:35:43
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稻草人的学习

银虫 (小有名气)
1mm电转杯用什么电击条件能转进去啊，我也是1mm的，转了两次没成功，电压1500  电阻200  电容25，谢谢
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10楼2014-05-04 20:06:30
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