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格格Caroline

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白质很纯，但不长晶体

小妹刚刚学习蛋白质结晶，有很多不会的地方。
我做的蛋白350个aa，很纯了，点晶体就是不长，不是直接沉淀了就是透明的，预测了没有什么信号肽之类的，求助啊！！！！！！！就是不长~！！！！我应该在哪些方面在进行改进呢！！！谢谢谢谢！
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蛋白质实验技术 【分子生物】EPI帖

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1楼 2012-02-14 21:34:37
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回帖置顶 ( 共有2个 )

BioChemCom

银虫 (小有名气)
格格Caroline: 回帖置顶 2012-02-15 20:26:04
西瓜(金币+3): Good！ 2012-02-15 22:21:27
这个方面的问题，其实挺复杂的，你给出的哦信息也不够明确。我觉得有几件事情需要考虑。
1. 你的蛋白构建是不是够好，两端的无规则序列是否删除了？
2. 就算两端都删除了，还是要做一系列的截断构建，用于探索可能的稳定表达的结构域。这些可以通过已有的晶体结构、生物信息学相关的分析软件来获得信息。
3. 纯化过程，也有一些问题要考虑，温度、Ni-NTA，分子筛和离子柱。

希望有更详细的信息。
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3楼2012-02-15 17:16:51
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BioChemCom

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 辛苦~ 2012-02-15 22:22:07
格格Caroline(金币+3): ★★★★★最佳答案 2012-02-16 10:45:29
1. 如果是个“乙烯形成酶”（乙烯合成酶？），那么这个信息挺好的。你可以用Pfam，SMART或者Uniprot确定这个酶的domain区，一般来说，C端或者N端还是会有一些无规则序列。可以适当的截断，多尝试几种构建。

2. 在PDB里面，找找同源的晶体结构，其实Uniprot里面会提供。很多时候，SMART也会给出来，这里也可以获得很多结构信息或者序列信息。

3. 二级结构的预测，一般来说，PSIPRED比较权威。比较好使。

4. 不管有没有二硫键，只要有Cys的话，就要在纯化的过程中，加入一些DTT，巯基乙醇或者TECP。

5. 如果是金属辅酶的话，要看情况，在表达过程（可以和IPTG同时加）中或者裂解细胞过程中加入相应的盐溶液。

6. 最关键的地方是：看文献，看看以前的研究给出那些信息。
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格格Caroline
6楼2012-02-15 20:44:13
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普通回帖

wgl365

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
格格Caroline: 回帖置顶 2012-02-15 20:30:22
格格Caroline: 取消置顶 2012-02-15 20:30:43
你点晶体要用那个筛选试剂盒呀！有很多条件的呀！都不长吗？
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思想是行动的种子！
2楼2012-02-15 17:12:29
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nach

铜虫 (著名写手)

不让吃就去死

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
ph 和沉淀剂浓度 是最先考虑的
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不让吃就去死
4楼2012-02-15 20:02:05
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格格Caroline

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by BioChemCom at 2012-02-15 17:16:51:
这个方面的问题，其实挺复杂的，你给出的哦信息也不够明确。我觉得有几件事情需要考虑。
1. 你的蛋白构建是不是够好，两端的无规则序列是否删除了？
2. 就算两端都删除了，还是要做一系列的截断构建，用于探索可 ...

我的蛋白是个乙烯形成酶，我拿软件预测了，应该是没有信号肽之类的，但是不同软件预测的二级结构不同，搞得我想截断也不知道确切去哪里截。

然后...我今天考虑到是不是加点Mn离子 和akg.看能不能长晶体。

再就是，我最后能想出的是 建模之后预测至少有一个二硫键，看加点DTT？
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5楼2012-02-15 20:28:47
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格格Caroline

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by BioChemCom at 2012-02-15 20:44:13:
1. 如果是个“乙烯形成酶”（乙烯合成酶？），那么这个信息挺好的。你可以用Pfam，SMART或者Uniprot确定这个酶的domain区，一般来说，C端或者N端还是会有一些无规则序列。可以适当的截断，多尝试几种构建。

2. ...

好！！！谢谢您！！！昨晚找了一个同源性还行的，正在参考中，非常感谢。
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7楼2012-02-16 10:47:11
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wgl365

银虫 (小有名气)
关于截断，可以查一些文献，比如下面地址给的这个：http://nar.oxfordjournals.org/co ... key=GQEeSFzsvhDbnDz，给出了一个网站，
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思想是行动的种子！
8楼2012-02-16 12:24:13
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BioChemCom

银虫 (小有名气)
这是一个设计construct的程序，集成了不同的分析方法。是一个好的选择，其实我觉得阅读文献是个必需要做的事情，不论是针对你这个蛋白本身，还有该领域里的文献，本领域的论坛交流（当然也包括了来这里问问题）。

从问问题的内容来看，感觉上楼主对于蛋白结晶这块不够了解，如果是在专业的课题组，学习起来会方便些，但是文献的体会和领悟，出了阅读外，和你对课题投入的多少也有关系。
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9楼2012-02-16 13:02:12
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格格Caroline

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by BioChemCom at 2012-02-16 13:02:12:
这是一个设计construct的程序，集成了不同的分析方法。是一个好的选择，其实我觉得阅读文献是个必需要做的事情，不论是针对你这个蛋白本身，还有该领域里的文献，本领域的论坛交流（当然也包括了来这里问问题）。 ...

恩呢，刚开始做，要学的很多，谢谢您！
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10楼2012-02-17 13:30:20
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