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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 双酶切问题
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 双酶切问题

双酶切质粒载体，酶切完全后得到两个片段：约5000bp和100bp，通常回收PCR不容易检测到100bp的条带，这样就不容易区分大片段是双酶切后产物的还是单酶切产物。当然，采用高浓度凝胶可以检测出100bp的条带，不知道还有没有其他简单易行的方法进行区分呢，欢迎指教。
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1楼 2012-02-07 10:54:59
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)
★
joan198108(金币+1):谢谢参与
跑PAGE胶
胶回收自连

酶切载体是为了克隆吧，直接往下做，再做一个自连对照看看
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2楼2012-02-07 12:49:58
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★ ★
joan198108(金币+1):谢谢参与
看天(金币+2): 鼓励交流 2012-02-07 13:20:36
常用的一些高效率的限制性内切酶如BamHI、EcoRI等酶切几个小时就完全酶切了，你所提到的这个问题就不存在。如果是低效率的限制性内切酶，最好过夜酶切。

最好能切胶回收5000bp的酶切产物，毕竟你的另一段有100bp。

前些年的时候国产试剂盒的质量比较差，虽说能回收100以上的DNA片段，但是基本上回收不到100bp。现在国产试剂盒的质量也比较高了，100bp的片段过PCR柱纯化试剂盒残留太多，连接很容易重新连回到载体上。‘
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3楼2012-02-07 13:01:21
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by 香菱儿 at 2012-02-07 12:49:58:
跑PAGE胶
胶回收自连

酶切载体是为了克隆吧，直接往下做，再做一个自连对照看看

自连是个不错的方法，比较直观，就是操作复杂了些。谢谢指教！
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4楼2012-02-07 13:21:12
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by brightfuture01 at 2012-02-07 13:01:21:
常用的一些高效率的限制性内切酶如BamHI、EcoRI等酶切几个小时就完全酶切了，你所提到的这个问题就不存在。如果是低效率的限制性内切酶，最好过夜酶切。

最好能切胶回收5000bp的酶切产物，毕竟你的另一段有100 ...

现在最关键的问题是5000bp附近片段是已经完全双酶切还是只是单酶切的产物，我想请教一下有没有简单的验证方法。
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5楼2012-02-07 13:44:55
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
引用回帖:
5楼: Originally posted by joan198108 at 2012-02-07 13:44:55:
现在最关键的问题是5000bp附近片段是已经完全双酶切还是只是单酶切的产物，我想请教一下有没有简单的验证方法。

这个还不简单么，一个PCR搞定。
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7楼2012-02-07 14:17:21
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cxl_yll

木虫 (正式写手)
★
joan198108(金币+1):谢谢参与
跑一个单酶切的，跑一个双酶切的，在一个胶上跑，双酶切的比单酶切的要低一点。我用这个方法检测过相差200bp的，没有问题。是不是能多送我金币啊~~
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joan198108
8楼2012-02-09 09:01:14
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by brightfuture01 at 2012-02-07 14:17:21:
这个还不简单么，一个PCR搞定。

PCR还要设计合成引物，应该是比较麻烦的吧
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9楼2012-02-09 09:33:58
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by cxl_yll at 2012-02-09 09:01:14:
跑一个单酶切的，跑一个双酶切的，在一个胶上跑，双酶切的比单酶切的要低一点。我用这个方法检测过相差200bp的，没有问题。是不是能多送我金币啊~~

我的只是相差100bp，并且另一个片段5000bp+，上面的方法恐怕是不太容易观察。金币就不送了，给朵小红花吧，呵呵
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10楼2012-02-09 09:36:23
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★
joan198108(金币+1):谢谢参与
你这个问题如果是应付上图的那种我给你个建议，不知道行不行，我之前尝试过用两块同样大小的胶但是浓度不同，在同样位置来跑，照相的时候两个胶叠在一起，5000的那个放下面，你可以试试，应付上图可以，如果酶用的好就不用担心是酶切有问题了，因为肯定没问题。
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11楼2012-02-09 10:59:20
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cxl_yll

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by joan198108 at 2012-02-09 09:36:23:
我的只是相差100bp，并且另一个片段5000bp+，上面的方法恐怕是不太容易观察。金币就不送了，给朵小红花吧，呵呵

我大片段5000bp多，附件1孔mark,2,3孔质粒，4-7双酶切，8-11是对应的双酶切。我的不太明显，你可以胶浓度大一些，电压低一些，跑胶时间长一些。
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12楼2012-02-09 15:39:21
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cxl_yll

木虫 (正式写手)
我相差也是100bp
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13楼2012-02-09 15:40:36
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by cxl_yll at 2012-02-09 15:39:21:
我大片段5000bp多，附件1孔mark,2,3孔质粒，4-7双酶切，8-11是对应的双酶切。我的不太明显，你可以胶浓度大一些，电压低一些，跑胶时间长一些。

请问你的凝胶浓度多大，浓度太高溶解是个问题，你是如何溶胶的呢？
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14楼2012-02-09 15:56:03
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cxl_yll

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by joan198108 at 2012-02-09 15:56:03:
请问你的凝胶浓度多大，浓度太高溶解是个问题，你是如何溶胶的呢？

胶是3%的，你TAE可以稍微多加一点，它一加热挥发厉害，加热一会，瑶一会，电压可以设成90-100伏
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15楼2012-02-09 22:49:48
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by cxl_yll at 2012-02-09 22:49:48:
胶是3%的，你TAE可以稍微多加一点，它一加热挥发厉害，加热一会，瑶一会，电压可以设成90-100伏

多谢！
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16楼2012-02-10 08:46:41
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clarktao6楼
2012-02-07 13:52   回复  
joan198108(金币+1):谢谢参与
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