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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 双酶切问题
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 双酶切问题

双酶切质粒载体，酶切完全后得到两个片段：约5000bp和100bp，通常回收PCR不容易检测到100bp的条带，这样就不容易区分大片段是双酶切后产物的还是单酶切产物。当然，采用高浓度凝胶可以检测出100bp的条带，不知道还有没有其他简单易行的方法进行区分呢，欢迎指教。
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1楼 2012-02-07 10:54:59
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★ ★
joan198108(金币+1):谢谢参与
看天(金币+2): 鼓励交流 2012-02-07 13:20:36
常用的一些高效率的限制性内切酶如BamHI、EcoRI等酶切几个小时就完全酶切了，你所提到的这个问题就不存在。如果是低效率的限制性内切酶，最好过夜酶切。

最好能切胶回收5000bp的酶切产物，毕竟你的另一段有100bp。

前些年的时候国产试剂盒的质量比较差，虽说能回收100以上的DNA片段，但是基本上回收不到100bp。现在国产试剂盒的质量也比较高了，100bp的片段过PCR柱纯化试剂盒残留太多，连接很容易重新连回到载体上。‘
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3楼2012-02-07 13:01:21
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)
★
joan198108(金币+1):谢谢参与
跑PAGE胶
胶回收自连

酶切载体是为了克隆吧，直接往下做，再做一个自连对照看看
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2楼2012-02-07 12:49:58
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by 香菱儿 at 2012-02-07 12:49:58:
跑PAGE胶
胶回收自连

酶切载体是为了克隆吧，直接往下做，再做一个自连对照看看

自连是个不错的方法，比较直观，就是操作复杂了些。谢谢指教！
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4楼2012-02-07 13:21:12
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by brightfuture01 at 2012-02-07 13:01:21:
常用的一些高效率的限制性内切酶如BamHI、EcoRI等酶切几个小时就完全酶切了，你所提到的这个问题就不存在。如果是低效率的限制性内切酶，最好过夜酶切。

最好能切胶回收5000bp的酶切产物，毕竟你的另一段有100 ...

现在最关键的问题是5000bp附近片段是已经完全双酶切还是只是单酶切的产物，我想请教一下有没有简单的验证方法。
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5楼2012-02-07 13:44:55
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