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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)


[交流] 双酶切问题

双酶切质粒载体,酶切完全后得到两个片段:约5000bp和100bp,通常回收PCR不容易检测到100bp的条带,这样就不容易区分大片段是双酶切后产物的还是单酶切产物。当然,采用高浓度凝胶可以检测出100bp的条带,不知道还有没有其他简单易行的方法进行区分呢,欢迎指教。
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)


引用回帖:
: Originally posted by brightfuture01 at 2012-02-07 13:01:21:
常用的一些高效率的限制性内切酶如BamHI、EcoRI等酶切几个小时就完全酶切了,你所提到的这个问题就不存在。如果是低效率的限制性内切酶,最好过夜酶切。

最好能切胶回收5000bp的酶切产物,毕竟你的另一段有100 ...

现在最关键的问题是5000bp附近片段是已经完全双酶切还是只是单酶切的产物,我想请教一下有没有简单的验证方法。
5楼2012-02-07 13:44:55
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)



joan198108(金币+1):谢谢参与
跑PAGE胶
胶回收自连

酶切载体是为了克隆吧,直接往下做,再做一个自连对照看看
2楼2012-02-07 12:49:58
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★ ★ ★
joan198108(金币+1):谢谢参与
看天(金币+2): 鼓励交流 2012-02-07 13:20:36
常用的一些高效率的限制性内切酶如BamHI、EcoRI等酶切几个小时就完全酶切了,你所提到的这个问题就不存在。如果是低效率的限制性内切酶,最好过夜酶切。

最好能切胶回收5000bp的酶切产物,毕竟你的另一段有100bp。

前些年的时候国产试剂盒的质量比较差,虽说能回收100以上的DNA片段,但是基本上回收不到100bp。现在国产试剂盒的质量也比较高了,100bp的片段过PCR柱纯化试剂盒残留太多,连接很容易重新连回到载体上。‘
3楼2012-02-07 13:01:21
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)


引用回帖:
: Originally posted by 香菱儿 at 2012-02-07 12:49:58:
跑PAGE胶
胶回收自连

酶切载体是为了克隆吧,直接往下做,再做一个自连对照看看

自连是个不错的方法,比较直观,就是操作复杂了些。谢谢指教!
4楼2012-02-07 13:21:12
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