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PCR扩增不出来怎么回事啊？已有2人参与
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引物退火温度是61度，发夹结构和dimer都很低，没有错配，按55,56度扩增，没有条带，今天又做了梯度PCR,从53到64，还是没有，40个循环，产物长度1500bp左右，用润德的mix（实验室一直在用，2k都能出来）和LA Taq都没有条带，有没有高手知道是什么原因啊？？ [ Last edited by 1949stone on 2012-2-5 at 20:10 ] |
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2楼2012-02-03 19:49:00
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【答案】应助回帖
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PCR不出现扩增条带（假阴性）（作者：凌波丽） 2013-10-3 PCR反应的主要的关键环节有:1.模板DNA的质量，2.模板DNA的长度过大，2.酶的质量，3.缓冲溶液变质需要更换，3.引物的质量，5.Mg2+ 浓度，6.反应体积的改变,7.物理原因，8.靶序列变异。 楼主的情况是不出现扩增条带，问题与解决如下： 下面是寻找原因并且针对上述环节进行分析原因与相应的对策，最后写出了调整顺序。 I. 原因及相应的对策： 1. DNA模板不纯，混入了杂质：(1)模板中含有杂蛋白质。(2)模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，此时A260/A280>1.8。(3)DNA模板溶液吸入了酚或者SDS。对策：重新提取DNA模板，去除蛋白质（比如：用Tris-HCl+饱和酚抽提DNA，DNA融于水相，同时变性沉淀蛋白质位于水相与苯酚相之间，可用吸管吸走变性沉淀蛋白质层，接着弃去苯酚相，最后用乙醇沉淀DNA）和小分子（透析、超滤等）。 2. DNA模板发生了降解：反复冻融或者长期在冰箱的冷藏箱里，导致降解。使用凝胶电泳检验DNA模板是否存在降解，即有有明显弥散带出现。如果DNA模板存在降解则用为降解的DNA模板，或者重新提取DNA模板。 3. DNA聚合酶失活或者专一性不够。 增加DNA聚合酶的专一性。 （1）改用专一性更强的DNA聚合酶，或者使用两种不同的DNA聚合酶，减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。 （2）酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油，若此操作引起酶的浓度过高，可以适当加双蒸馏水稀释。 （3）如果靶片段GC含量，可以加强Taq DNA聚合酶的专一性。可在反应体系中加入：1-1.5mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率，两者可以增加Taq DNA聚合酶的稳定性。 或者需更换不同种类的新酶。可以将新旧两种酶同时分别在不同的PCR体系中使用，以此分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。 需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。注意模板里是否含有酶的抑制剂，模板里是否含有酚。酶制剂里多含有甘油，酶的浓度大了甘油也会多，可能会抑制PCR反应。增加DNA聚合酶的专一性。 4. 如果靶片段长于3kd应该用长片段PCR方法进行扩增，实际上就是所用的DNA聚合酶有校对活性。 5. 缓冲溶液：最好都是新配置的，类别浓度要正确别加错了，这步可能是太基本很不被注意。 6. 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：(1)选定一个好的引物合成单位。(2)引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，需要调整引物的浓度，在反应时加入浓度基本相同的引物。(3)引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。(4)引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。（5）在引物的Tm范围内，选择较高的复性问题可以大大减少引物与模板的非特异性的结合，提高PCR反应的特异性。（6）引物3’末端用GC可以增加PCR的专一性扩增。 7. Mg2+ 浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。Mg2+ 浓度一般可能与的dNTP浓度存在同方向偶联效应。 8. 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20μL、30μL、50μL或100μL，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20μL 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 9. 物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。没有重新设计引物，不要大范围地变动反应体系的复性温度，要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。 10. 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。这需要重新设计引物。 II.一般的调整顺序： 1.若PCR反应后无任何产物，则首先更换缓冲溶液，使用全新配置的缓冲溶液。 2.紧随其后是用电泳测定DNA模板的质量，如果模板质量有问题则需要重新提取DNA模板。检测和重新提取DNA模板（包括用质谱或者电泳检测DNA是否变短，清除酚和SDS，检测模板浓度，必要时要对DNA模板测序）。 3.调整Mg2+ 浓度，Mg2+ 浓度不高于10.0mmol/L，不低于1.0mmol/L，调整时从低往高分梯度加，每次升高0.05mmol/L.最常使用Mg2+ 浓度为1.5mmol/L。 4.调节dNTP的浓度。一般是先调整Mg2+ 浓度，一般除非Mg2+ 初始浓度即很高，否则加高Mg2+ 浓度的同时一般可以大致相同比例地同时地调节dNTP的浓度。如果不是很确定dNTP的浓度是否合适时，可以先独立调节Mg2+浓度，而后是需要再调节dNTP的浓度。dNTP的浓度的决定不只有Mg2+浓度一种因素。在对应调节Mg2+浓度而调节dNTP的浓度后，还可以根据其他因素适当微调dNTP的浓度。最后重新设计引物，其他顺序可变。再往后，、换成其他类型的DNA聚合酶和使用梯度降低dNTP。 5.调整引物浓度，在调整引物与模板的结合温度。 6.增加DNA聚合酶的专一性，或者使用专一性更高的酶。 7.可以使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时，非特异性扩增较多，这时，最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环，退火温度降低1-2度，直至到达正常的Tm附近的退火温度。 8. 以上这些都做了仍未奏效，那么就要重新设计引物了。 9. 如果靶片段长于3kd应该用长片段PCR方法进行扩增，实际上就是所用的DNA聚合酶有校对活性。Long Range PCR protocol 的具体内容可以在网上查一下，已经哟专门的商用的Long Range PCR protocol试剂盒出售。 调整的顺序不是完全固定的，可以根据需要灵活掌握，一般是按照调节的先易后难的顺序。 长片段PCR不同于一般PCR的特殊要求 2014-7-11 3kd-20kd的DNA片段适用长片段PCR扩增。 1.用Taq-LA DNA聚合酶，该酶是Taq酶或Klentaq 1（无纠错功能）与pfu酶或Deep Vent酶（有纠错功能）的混合物，以Taq酶为主。 2.当需要扩增的片段大于20kd时，需要加入高浓度的甜茶碱（终浓度为1.5-2.0mol/L)，提高PCR的效率，但是甜茶碱加入后，要将扩增反应的温度降低2-3度。楼主的扩增片段还到不了20kd,甜茶碱可以少加点。 3.适当升高镁离子浓度，不要太高了镁离子浓度高于底物dNTP浓度即可。 4.变性时间要短，尤其是一般不超过30 s，尤其是模板长度超过8KD时更是如此，变性时间长会破坏模板。 5.延伸温度可以下降为68摄氏度，同时加长延伸反应时间，长度为3-5kd的模板延伸反应时间为5-10分钟，长度为20-35kd的模板延伸反应时间为20分钟，楼主的PCR的延伸反应时间可能为12-16分钟左右。 6.模板浓度最好在1ng/L以内。 7.应用长片段PCR缓冲溶液。10X长片段PCR缓冲溶液组成为：500 mmol/L Tris-Cl(pH=9.0),160 mmol/L硫酸铵，25 mmol/L MgCl2,1.5mmol/L BSA。 8.设计较长的PCR引物（25-30 bp) 其他同普通PCR。 |
14楼2014-07-17 03:19:08
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