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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » [重金求助] 细菌鉴定的若干入门级问题请教(16S rDNA)
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zhaott

荣誉版主 (著名写手)

小虫爸

[求助] [重金求助] 细菌鉴定的若干入门级问题请教(16S rDNA)

从前一直搞环境工程，后来筛选到了甲烷氧化菌一株，但经过了一系列的鉴定工作，发现了很多问题，大致过程如下：
（1）最开始是把多次传代（甲烷为唯一碳源）的固体平板寄给了大连宝生物公司，通过PCR 扩增产物直接测序未发现套峰，但测序结果经NCBI比对并不属于甲烷氧化菌，而是另一种属（暂时命名为菌X）；
（2）本以为菌X是一种新的可氧化甲烷的细菌，但相关领域专家都认为菌株不纯，所以自己也开始怀疑是否体系有杂菌。
（3）最近在国外访学，开始尝试自己提取16S，选用了广普微生物扩增引物（F27和R14），首先用一种高保真的酶没有扩增出来，之后换了另一种（易扩增但个别碱基可能突变）成功，扩增后测序。无奈的是美国这边服务很有限，只告知了2个测序反应的结果，并未给出最终的16S rDNA序列。

请各位熟悉相关实验的虫友协助分析并解答一下问题：
（1）是否存在这种可能：虽然平板上菌株主要为甲烷氧化菌，但广普引物无法扩增出甲烷氧化菌，却扩增出来了与之共存的另一种杂菌。
也就是说，采用以上引物，对2个或者以上的细菌混合物进行PCR，可能只扩增出一种。
（2）如何根据测序反应的结果，将两个反应结果合并为一个完整的16S rDNA序列。
多谢！！！
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人生总有限功业总无涯
1楼 2012-01-17 07:33:40
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回帖置顶 ( 共有2个 )

zhaott

荣誉版主 (著名写手)

小虫爸
★
zhaott: 回帖置顶 2012-01-19 10:36:54
zhang8826857(金币+1): gl 2012-01-19 11:57:03
请各位虫友能够介绍的仔细一些，因为一些广普知识我也了解，所以希望能够根据我所提的实际情况给予分析：
（1）很多人认为不纯，但根据现有情况，如何进一步提纯？
我想分离的甲烷氧化菌，所以希望有过类似经验的虫友。
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人生总有限功业总无涯
9楼2012-01-19 10:35:48
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zhaott

荣誉版主 (著名写手)

小虫爸
引用回帖:
楼: Originally posted by girlfisher at 2012-01-20 10:10:34:
1. 如果楼主可以通过采用某些甲烷氧化基因的通用引物PCR+测序来确定是否存在甲烷氧化菌，前提是有这种引物。

2.你确定你的甲烷氧化菌是细菌不是古菌？

3.对于混合菌群，在提取DNA过程中可能存在bias，某些细 ...

感谢您的宝贵意见！
1、我们的用的引物是很多文献报道，用来提取纯甲烷氧化菌；
2、不是古菌，产甲烷菌是古菌；
3、这个信息很重要，不过没有相关的经验，也没有见过类似的资料；
4、克隆的前提也是目标菌能被PCR出来，而我们的PCR产物测序无套峰，这说明了只有一种PCR产物扩增出来，所以继续克隆的意义似乎不大。
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人生总有限功业总无涯
11楼2012-01-20 11:59:13
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普通回帖

catty2000

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
scelab(金币+2): 谢谢回复哦~ 2012-01-17 18:15:52
zhaott(金币+1): ★有帮助 这些我也知道，但如何进行呢？已经传了十几代 2012-01-19 10:39:37
1.继续纯化菌种
2.两个测序反应的结果可以用了，在上面找到引物的序列，两段引物序列之间的序列应该就是16S rDNA序列
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2楼2012-01-17 11:07:36
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privateer2015

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
rainwander(金币+1): 鼓励交流 2012-01-17 18:56:31
zhaott(金币+49): ★有帮助 谢谢 2012-01-19 10:40:28
zhang8826857(金币-49): lz给了一个金币，给我说好像是加错了，呵呵，不好意思啊 2012-01-20 19:05:32
zhang8826857(金币+5): 唉，我真二，呵呵，给你扣光了，当补偿下吧 2012-01-20 19:06:44
可直接用DNAMAN等软件将2个反应的结果比对一下，按重复部分的进行拼接就可以得到完整的一条序列了
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3楼2012-01-17 11:10:38
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zhaott

荣誉版主 (著名写手)

小虫爸
zhaott: 回帖置顶 2012-01-19 03:09:15
zhaott: 取消置顶 2012-01-19 10:37:08
请各位说的详细一些！！
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人生总有限功业总无涯
4楼2012-01-17 13:06:52
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longage.gene

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by catty2000 at 2012-01-17 11:07:36:
1.继续纯化菌种
2.两个测序反应的结果可以用了，在上面找到引物的序列，两段引物序列之间的序列应该就是16S rDNA序列

如果你说的1不对的话，现在做2就没意义了。
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5楼2012-01-17 16:42:48
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cxg608

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
rainwander(金币+1): 鼓励交流 2012-01-17 18:56:42
可以用ContigExpress软件对所测序列进行拼接，具体使用方法可以在网上baidu一下。
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6楼2012-01-17 17:32:59
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msw0103

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857(金币+1): 鼓励交流 2012-01-18 11:47:29
首先就如1楼所说的，继续纯化，挑取单克隆进行16S rDNA序列扩增（可以多挑几个，也可以换几对扩增引物），然后送测序，把得到的序列用chromose处理（去掉前面的30-40个碱基和大约800bp之后的序列），得到两个反应序列用DNAman拼接（DNAman中有一个sequence assemble，导入你得到的两个处理过的序列就可以），就能得到16S rDNA的全长，放在NCBI里面blastn一下就知道是哪个菌了。
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7楼2012-01-18 08:05:34
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redbull2011

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
先纯化，没纯化其它的做了也没意义，，很多公司16s测序都直接给拼接好的
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8楼2012-01-18 22:23:12
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girlfisher

金虫 (小有名气)
★
zhang8826857(金币+1): 鼓励交流 2012-01-20 19:10:29
1. 如果楼主可以通过采用某些甲烷氧化基因的通用引物PCR+测序来确定是否存在甲烷氧化菌，前提是有这种引物。

2.你确定你的甲烷氧化菌是细菌不是古菌？

3.对于混合菌群，在提取DNA过程中可能存在bias，某些细菌由于提取方法的无效而产率很低。

4. 如果共存多种细菌而甲烷菌以优势存在，可以做克隆文库，多测一些克隆子来获得甲烷氧化细菌的16S序列。
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10楼2012-01-20 10:10:34
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