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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 求助高手，我用手提的土壤DNA，用什么方法纯化
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旋之木

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助高手，我用手提的土壤DNA，用什么方法纯化

我用手提的土壤总DNA，之前用过切胶回收，但是切胶回收的产物做PCR效果不好。用soilmaster DNA 纯化效果还不错，但是再买说已经停产了，不知道有没有其他好的纯化方法，求高手指教~~~
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1楼 2011-12-18 11:24:21
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yaoyl0679

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857(金币+1): 鼓励应助，加油 2011-12-19 09:49:13
还是用试剂盒吧，手工提的话很费时间，而且效果不好，做PCR效果比较差，可以用MoBIo等
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2楼2011-12-18 11:36:52
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匿名

用户注销 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
amisking(应助指数-1): 2011-12-18 17:56:52
amisking:编辑内容 2011-12-18 17:57
本帖仅楼主可见
3楼2011-12-18 12:21:21
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旋之木

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by yaoyl0679 at 2011-12-18 11:36:52:
还是用试剂盒吧，手工提的话很费时间，而且效果不好，做PCR效果比较差，可以用MoBIo等

哎，贵啊
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4楼2011-12-18 20:46:03
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暧醉殇

捐助贵宾 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857(金币+3): good 2011-12-19 09:49:23
方法我给你，我自己总结用电子天平分别称取土样各3g于磨口三角烧瓶内
用移液枪分别移取6mLDNA提取液加入到三角烧瓶内
从冰箱中取出蛋白酶K和溶菌酶放在手心焐热至溶化
用移液枪分别移取500uL和20uL溶菌酶和蛋白酶K于三角烧瓶内，然后塞上空心塞置于37℃恒温摇床上振荡30min，然后取出置于37℃恒温水浴锅内水浴1小时。
待水浴结束后分别加入1mL20%的SDS溶液，再将其置于65℃恒温水浴锅内水浴2小时
待水浴结束后，取出分别加入2.51mL的6mol/L的氯化钠溶液剧烈振荡，倒入离心管12000r/min离心15分钟
取上清液将其分成3分每份均取0.4mL置于灭过菌的离心管内，然后加入0.4mL的苯酚：氯仿：异戊醇=25：24：1的溶液，然后12000r/min离心5分钟
离心后取上清液加入等体积的氯仿：异丙醇=24：1的溶液然后置于离心机12000r/min离心5分钟
取出上清液加入2倍提及的无水乙醇室温下沉淀20~30分钟
待沉淀完12000r/min离心10分钟
弃去上清液加入200uL的TE缓冲液使沉淀溶解
放置在-20℃冰箱保存出来的，效果还不错的！方法步骤如下：
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5楼2011-12-18 22:18:23
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旋之木

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by 暧醉殇 at 2011-12-18 22:18:23:
方法我给你，我自己总结用电子天平分别称取土样各3g于磨口三角烧瓶内
用移液枪分别移取6mLDNA提取液加入到三角烧瓶内
从冰箱中取出蛋白酶K和溶菌酶放在手心焐热至溶化
用移液枪分别移取500uL和20uL溶菌酶和蛋白 ...

这种方法提出来的ＤＮＡ腐殖质能除去吗？
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6楼2011-12-19 09:46:58
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暧醉殇

捐助贵宾 (小有名气)

【答案】应助回帖

可以~跑胶的亮度还不错的~~祝成功哦！
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7楼2011-12-19 12:03:41
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
腐殖酸是很难去除的，好像它是结合在DNA上的，切胶回收是去不掉的。所以土壤DNA用于PCR一般来说效果不是很理想的。我们一直都是用MIBIO提取的，腐殖酸之类的杂质也会有的。PCR你可以加入一些添加剂，如BSA（能提高PCR特异性）
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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
8楼2011-12-19 22:13:24
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yuer9809

至尊木虫 (著名写手)
楼上你们用试剂盒提出来的直接做PCR效果如何？
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9楼2011-12-20 11:48:33
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cam315

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

土壤样品，最好还是用Mobio公司的Power Soil DNA Kit试剂盒提取总DNA，然后PCR扩增，省时间。但是比较贵。手工提取很难有效去除腐植酸。
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10楼2013-03-05 04:38:22
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