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造血干细胞

铜虫 (初入文坛)

[求助] 连接失败,求解

载体:4.5kb,酶切前nano drop测250ng/ul,酶切后割胶回收nano drop测10ng/ul,
片段:引物复性所得,电泳检测纯度良好无杂带
连接体系:
T4buffer:1
T4ligase :1
载体:3
片段:1
ddH2O:4
total:10
快速连接22C,1hour,后边是转化步骤，今天早上看得板子上没有菌落，电泳检测了下，连接产物，什么都没有！咋个回事啊？我的片段不是很长，应该很好连的啊，但是问题是，连接完了什么都没有了...

[ Last edited by 1949stone on 2011-12-16 at 12:20 ]
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1楼2011-12-16 11:51:20
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catmihzh

木虫 (小有名气)

虫虫特攻队队长
我的情况和楼主差不多，做了好几次连接转化，对照都长了，实验组都不长
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[url=http://weibo.com/2152924384?s=6uyXnP][img]http://service.t.sina.com.cn/widget/qmd/2152924384/13d43368/7.png[/img][/url]
2楼2011-12-16 12:33:23
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+2): 鼓励应助！ 2011-12-16 14:29:35
直接合成的引物，溶解后浓度是很高的。片段的分子数是载体的分子数的3-10倍，两位再好好算算。可以考虑将载体的用量增加一点（50-100ng),但外源片段的量肯定需要减少很多倍。，过多的小片度也会对正确连接产生严重的干扰
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3楼2011-12-16 13:21:21
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liaotiantian

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
amisking(金币+1): 鼓励发帖交流。 2011-12-16 18:42:00
T4buffer:1
T4ligase :1
载体:1
片段:3
ddH2O:4
total:10
或者不加水了，除了T4的东西，其他全部用外源和载体回收产物，外源的要比载体多一些。一般外源和载体摩尔比3：1 ，4：1。我甚至连过7：1的。
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4楼2011-12-16 14:01:27
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wccc

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
载体酶切后浓度差异太多了吧？？
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5楼2011-12-16 16:10:55
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造血干细胞

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by liaotiantian at 2011-12-16 14:01:27:
T4buffer:1
T4ligase :1
载体:1
片段:3
ddH2O:4
total:10
或者不加水了，除了T4的东西，其他全部用外源和载体回收产物，外源的要比载体多一些。一般外源和载体摩尔比3：1 ，4：1。我甚至连过7：1的。

carrier浓度那么低还要比载体多？
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6楼2011-12-16 16:20:26
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造血干细胞

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by wccc at 2011-12-16 16:10:55:
载体酶切后浓度差异太多了吧？？

是的,这次体系有点大了,回收最后一步应该用20ul的体系了,结果用的50,不过这个效率和9月份做的时候差不多,不知道是试剂盒的问题还是酶,可以的话请你提供点信息把
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7楼2011-12-16 16:23:34
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wxy1989714

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+1): 鼓励应助 2011-12-17 12:25:11
会不会是你的载体浓度高了，而片段太少了？片段比载体该多些~~
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树叶飞舞，火之意志。
8楼2011-12-16 16:24:50
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造血干细胞

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by panda73 at 2011-12-16 13:21:21:
直接合成的引物，溶解后浓度是很高的。片段的分子数是载体的分子数的3-10倍，两位再好好算算。可以考虑将载体的用量增加一点（50-100ng),但外源片段的量肯定需要减少很多倍。，过多的小片度也会对正确连接产生严重 ...

我载体浓度太低了,难道还要再多加片段?我之前的比例是载体/片段 1:3的,这次因为载数量少所以换了下
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9楼2011-12-16 16:26:43
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造血干细胞

铜虫 (初入文坛)
好的,明天我试一下,谢了各位
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10楼2011-12-16 16:29:53
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