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造血干细胞

铜虫 (初入文坛)

[求助] 连接失败,求解

载体:4.5kb,酶切前nano drop测250ng/ul,酶切后割胶回收nano drop测10ng/ul,
片段:引物复性所得,电泳检测纯度良好无杂带
连接体系:
T4buffer:1
T4ligase :1
载体:3
片段:1
ddH2O:4
total:10
快速连接22C,1hour,后边是转化步骤,今天早上看得板子上没有菌落,电泳检测了下,连接产物,什么都没有!咋个回事啊?我的片段不是很长,应该很好连的啊,但是问题是,连接完了什么都没有了...

[ Last edited by 1949stone on 2011-12-16 at 12:20 ]
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wxy1989714

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西瓜(金币+1): 鼓励应助 2011-12-17 12:25:11
会不会是你的载体浓度高了,而片段太少了?片段比载体该多些~~
树叶飞舞,火之意志。
8楼2011-12-16 16:24:50
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查看全部 13 个回答

catmihzh

木虫 (小有名气)

虫虫特攻队队长

我的情况和楼主差不多,做了好几次连接转化,对照都长了,实验组都不长
[url=http://weibo.com/2152924384?s=6uyXnP][img]http://service.t.sina.com.cn/widget/qmd/2152924384/13d43368/7.png[/img][/url]
2楼2011-12-16 12:33:23
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
wanhscn(金币+2): 鼓励应助! 2011-12-16 14:29:35
直接合成的引物,溶解后浓度是很高的。片段的分子数是载体的分子数的3-10倍,两位再好好算算。可以考虑将载体的用量增加一点(50-100ng),但外源片段的量肯定需要减少很多倍。,过多的小片度也会对正确连接产生严重的干扰
3楼2011-12-16 13:21:21
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liaotiantian

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
amisking(金币+1): 鼓励发帖交流。 2011-12-16 18:42:00
T4buffer:1
T4ligase :1
载体:1
片段:3
ddH2O:4
total:10
或者不加水了,除了T4的东西,其他全部用外源和载体回收产物,外源的要比载体多一些。一般外源和载体摩尔比3:1 ,4:1。我甚至连过7:1的。
4楼2011-12-16 14:01:27
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