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BIO-che

新虫 (小有名气)

[求助] 蛋白质纯化凝胶层析

我准备用凝胶层析的方法来纯化目标蛋白,计划要用S-200,不知上样时,要一次至少要上多少毫克的蛋白质溶液才行?多少毫升?每毫升多少毫克?
同时想问一下,S-200装柱时一定要一次性全装上才行吗?我的实验室是没有泵的,只能手工装?
蛋白质溶液是不是一定要垂直加入胶上?那么缓冲液也要直加入胶上吗?还有加入液体的上管道最远能够离胶面多远?如果胶上表面 积水过多,会不会影响结果?
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BIO-che

新虫 (小有名气)

但是一般的经验是要一次上的蛋白总浓度大于多少为好?
还有如果上样完后,在分子筛表面上有缓冲液,柱头还要求垂直吗?如果柱头的管子伸入分子筛表面上的缓冲液内,柱头还要求垂直吗?
6楼2011-12-09 16:47:02
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lihuan0525

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


西瓜(金币+1): Good! 2011-12-08 19:04:38
你可以买预装柱啊,没有泵能装好吗,装不好的话做了也没有效果,一般凝胶过滤的话上样量为柱体积的5%,脱盐的话可以多上的。
2楼2011-12-08 08:55:47
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lpw106

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good!欢迎常来哦~ 2011-12-08 19:05:10
BIO-che(金币+2): 不错 2011-12-16 21:12:17
分子筛吗?
1、分子筛的上样对蛋白量和浓度没有特别要求,一般关注上样体积(不超过5%),如果你想峰高点,可把蛋白总量提高点;
2、为了避免重力扩散,所有操作一般是up方向;
3、分子筛对柱效要求较高,如果你没有纯化系统来装,可能装出来的柱效也不好,分离效果也不好,建议先用预装柱试。
3楼2011-12-08 09:32:14
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cai198559

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): Good! 2011-12-08 19:05:32
自己装的柱,分辨率较预装柱差点,上样体积一般是柱体积的2-5%较合适,蛋白总量会影响分辨率的,总量太高,有可能会使你的蛋白纯化效果偏差,这取决于你要纯化前蛋白的纯度。
4楼2011-12-08 14:41:08
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