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you281115413

新虫 (初入文坛)

[求助] 放线菌PCR扩增的条件与扩增样品的量

扩增了很长时间,总是引物二聚体,没有个合适的好的程序,希望大家不吝赐教。
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plumplumgxc

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

TAKARA 有GC buffer,直接用就可以了
科研这条道不好走啊。。。
5楼2011-12-07 08:59:35
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guojing113

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励积极应助! 2011-12-06 20:08:37
在进行PCR扩增的时候,有引物二聚体是很正常的现在,如果引物设计的没有问题的话,正常扩增出结果应该没有问题,而放线菌的基因组的GC含量比较高,达到70%以上,一般的试剂扩增的效果也许不好,建议用专门的GC缓冲液做PCR实验
听雨
2楼2011-12-06 16:23:11
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williamskia

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
wolfebst(金币+3): 鼓励应助 2011-12-06 21:25:07
三个建议:
1)重新提取模版DNA并加大模版DNA的量
2)适当减少引物浓度
3)括增体系中加入5%-8%终浓度的DMSO。不用担心突变的问题,用活力比较低的pfu, PCR产物保真性很好的,也能比较好的有条带。
3楼2011-12-06 21:11:27
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小小亚杰

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
scelab(金币+4): 高手,谢谢回复哦~~~ 2011-12-07 00:16:25
1、可以加入DMSO 5~10%没问题。
2、引物、模板用一般的量就行了。
3、可以摸索温度梯度55——70℃。
预变性94℃  5min
变性 94  30S
退火 60  30S
延伸  72  30S
(30个循环)
延伸 72 10min(可缩短至3min)
4楼2011-12-06 23:54:00
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