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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 放线菌PCR扩增的条件与扩增样品的量
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you281115413

新虫 (初入文坛)

[求助] 放线菌PCR扩增的条件与扩增样品的量

扩增了很长时间，总是引物二聚体，没有个合适的好的程序，希望大家不吝赐教。
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1楼 2011-12-06 15:45:37
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guojing113

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励积极应助！ 2011-12-06 20:08:37
在进行PCR扩增的时候，有引物二聚体是很正常的现在，如果引物设计的没有问题的话，正常扩增出结果应该没有问题，而放线菌的基因组的GC含量比较高，达到70%以上，一般的试剂扩增的效果也许不好，建议用专门的GC缓冲液做PCR实验
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听雨
2楼2011-12-06 16:23:11
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williamskia

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
wolfebst(金币+3): 鼓励应助 2011-12-06 21:25:07
三个建议：
1）重新提取模版DNA并加大模版DNA的量
2）适当减少引物浓度
3）括增体系中加入5%-8%终浓度的DMSO。不用担心突变的问题，用活力比较低的pfu, PCR产物保真性很好的，也能比较好的有条带。
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3楼2011-12-06 21:11:27
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小小亚杰

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
scelab(金币+4): 高手，谢谢回复哦~~~ 2011-12-07 00:16:25
1、可以加入DMSO 5~10%没问题。
2、引物、模板用一般的量就行了。
3、可以摸索温度梯度55——70℃。
预变性94℃  5min
变性 94  30S
退火 60  30S
延伸  72  30S
（30个循环）
延伸 72 10min（可缩短至3min）
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4楼2011-12-06 23:54:00
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plumplumgxc

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

TAKARA 有GC buffer，直接用就可以了
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科研这条道不好走啊。。。
5楼2011-12-07 08:59:35
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