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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切
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wskxbxf

新虫 (小有名气)

[交流] 双酶切 已有1人参与

请大家指点：基因组DNA双酶切之后，为什么跑电泳什么都看不出来呢，上样量是10微升，是因为切完之后浓度太小了吗？还是别的什么原因，在做AFLP，酶切连接之后电泳都没有明显结果，但是做选扩增PCR结果弥散分布在100-1000bp之间，求指点 谢谢各位了
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【分子生物】EPI帖

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1楼 2011-12-06 10:45:22
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
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wanhscn(金币+2): 鼓励交流 2011-12-06 14:54:50
基因组DNA双酶切之后，为什么跑电泳什么都看不出来呢?很有可能是楼主的上样量太少！
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jiayoubashaonian
2楼2011-12-06 13:44:14
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wskxbxf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-12-06 13:44:14:
基因组DNA双酶切之后，为什么跑电泳什么都看不出来呢?很有可能是楼主的上样量太少！

谢谢回复 我用的是20微升的双酶切体系 DNA加的300ng左右，点样点了10微升 依您看 该点多少呢  求指导 不胜感激
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3楼2011-12-06 16:12:10
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
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amisking(金币+3, MolEPI+1): 鼓励积极应助！ 2011-12-06 20:05:34
楼主，我们当时做Southern blot时验证酶切是否完全是这样来的：DNA 浓度20-25ng/ul，酶切过夜后，取6-8ul加上loading buffer，0.8%胶，100V左右跑电泳验证。
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jiayoubashaonian
4楼2011-12-06 17:11:38
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wskxbxf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-12-06 17:11:38:
楼主，我们当时做Southern blot时验证酶切是否完全是这样来的：DNA 浓度20-25ng/ul，酶切过夜后，取6-8ul加上loading buffer，0.8%胶，100V左右跑电泳验证。

哦 那您当时加得几微的DNA做的酶切 用的多大的体系呢，非常感谢了
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5楼2011-12-06 19:04:10
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
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西瓜(金币+3): Good 2011-12-06 22:47:25
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5楼: Originally posted by wskxbxf at 2011-12-06 19:04:10:
哦 那您当时加得几微的DNA做的酶切 用的多大的体系呢，非常感谢了

我们当时是按照DNA量来定的，总量是6ug-10ug左右，200-400ul体系均可，以切成弥散的条带或出现卫星DNA条带为判断依据，蛋白除的干净些，防止回收时有白色的蛋白出来，我们用的NEB的酶，一般切24小时就可以了，中间多离心机次防止蒸发太多水分。
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jiayoubashaonian
6楼2011-12-06 19:10:54
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wskxbxf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-12-06 19:10:54:
我们当时是按照DNA量来定的，总量是6ug-10ug左右，200-400ul体系均可，以切成弥散的条带或出现卫星DNA条带为判断依据，蛋白除的干净些，防止回收时有白色的蛋白出来，我们用的NEB的酶，一般切24小时就可以了，中 ...

哦，我用的也是NEB的酶，因为后期做AFLP的实验，所以酶切体系不用太大，一般用的是20-50微升的体系，上样量呢？不知道跑电泳时您点的多少
非常感谢您的热心帮助
祝顺利
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7楼2011-12-06 20:06:40
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wskxbxf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by wskxbxf at 2011-12-06 20:06:40:
哦，我用的也是NEB的酶，因为后期做AFLP的实验，所以酶切体系不用太大，一般用的是20-50微升的体系，上样量呢？不知道跑电泳时您点的多少
非常感谢您的热心帮助
祝顺利

哦 不好意思 看见您前面回复的上样量了，非常感谢 我下次试着改变一下 谢谢了
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8楼2011-12-06 20:07:53
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wskxbxf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-12-06 19:10:54:
我们当时是按照DNA量来定的，总量是6ug-10ug左右，200-400ul体系均可，以切成弥散的条带或出现卫星DNA条带为判断依据，蛋白除的干净些，防止回收时有白色的蛋白出来，我们用的NEB的酶，一般切24小时就可以了，中 ...

您酶切24小时的效果怎么样，NEB的说明书上一般都是说几个小时就可以了，我用的双酶切其中有一种酶还是高保真酶，不知道您当时为什么选择切24小时，是因为切的时间短，效果不好吗
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9楼2011-12-06 20:17:34
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
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西瓜(金币+3): 专业啊！ 2011-12-06 22:47:45
引用回帖:
9楼: Originally posted by wskxbxf at 2011-12-06 20:17:34:
您酶切24小时的效果怎么样，NEB的说明书上一般都是说几个小时就可以了，我用的双酶切其中有一种酶还是高保真酶，不知道您当时为什么选择切24小时，是因为切的时间短，效果不好吗

当时我们做过不同时间点的酶切，几个小时内可以切开大部分的DNA，但跑胶时在10k以上的大分子量地方仍有堆积，后来延长时间到16-24-30-36都试过，到了24小时已经切完全了，跑出来是十分弥散的带，后来再做时就统一到24小时，看选择的酶是不是适合，切的是不是完全。
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jiayoubashaonian
10楼2011-12-06 20:37:25
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