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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切
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wskxbxf

新虫 (小有名气)

[交流] 双酶切 已有1人参与

请大家指点：基因组DNA双酶切之后，为什么跑电泳什么都看不出来呢，上样量是10微升，是因为切完之后浓度太小了吗？还是别的什么原因，在做AFLP，酶切连接之后电泳都没有明显结果，但是做选扩增PCR结果弥散分布在100-1000bp之间，求指点 谢谢各位了
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1楼 2011-12-06 10:45:22
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+3): 专业啊！ 2011-12-06 22:47:45
引用回帖:
9楼: Originally posted by wskxbxf at 2011-12-06 20:17:34:
您酶切24小时的效果怎么样，NEB的说明书上一般都是说几个小时就可以了，我用的双酶切其中有一种酶还是高保真酶，不知道您当时为什么选择切24小时，是因为切的时间短，效果不好吗

当时我们做过不同时间点的酶切，几个小时内可以切开大部分的DNA，但跑胶时在10k以上的大分子量地方仍有堆积，后来延长时间到16-24-30-36都试过，到了24小时已经切完全了，跑出来是十分弥散的带，后来再做时就统一到24小时，看选择的酶是不是适合，切的是不是完全。
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jiayoubashaonian
10楼2011-12-06 20:37:25
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
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wanhscn(金币+2): 鼓励交流 2011-12-06 14:54:50
基因组DNA双酶切之后，为什么跑电泳什么都看不出来呢?很有可能是楼主的上样量太少！
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jiayoubashaonian
2楼2011-12-06 13:44:14
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wskxbxf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-12-06 13:44:14:
基因组DNA双酶切之后，为什么跑电泳什么都看不出来呢?很有可能是楼主的上样量太少！

谢谢回复 我用的是20微升的双酶切体系 DNA加的300ng左右，点样点了10微升 依您看 该点多少呢  求指导 不胜感激
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3楼2011-12-06 16:12:10
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
amisking(金币+3, MolEPI+1): 鼓励积极应助！ 2011-12-06 20:05:34
楼主，我们当时做Southern blot时验证酶切是否完全是这样来的：DNA 浓度20-25ng/ul，酶切过夜后，取6-8ul加上loading buffer，0.8%胶，100V左右跑电泳验证。
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jiayoubashaonian
4楼2011-12-06 17:11:38
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