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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切
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wskxbxf

新虫 (小有名气)

[交流] 双酶切 已有1人参与

请大家指点：基因组DNA双酶切之后，为什么跑电泳什么都看不出来呢，上样量是10微升，是因为切完之后浓度太小了吗？还是别的什么原因，在做AFLP，酶切连接之后电泳都没有明显结果，但是做选扩增PCR结果弥散分布在100-1000bp之间，求指点 谢谢各位了
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【分子生物】EPI帖

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1楼 2011-12-06 10:45:22
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+3): Good 2011-12-06 22:47:25
引用回帖:
5楼: Originally posted by wskxbxf at 2011-12-06 19:04:10:
哦 那您当时加得几微的DNA做的酶切 用的多大的体系呢，非常感谢了

我们当时是按照DNA量来定的，总量是6ug-10ug左右，200-400ul体系均可，以切成弥散的条带或出现卫星DNA条带为判断依据，蛋白除的干净些，防止回收时有白色的蛋白出来，我们用的NEB的酶，一般切24小时就可以了，中间多离心机次防止蒸发太多水分。
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jiayoubashaonian
6楼2011-12-06 19:10:54
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
wanhscn(金币+2): 鼓励交流 2011-12-06 14:54:50
基因组DNA双酶切之后，为什么跑电泳什么都看不出来呢?很有可能是楼主的上样量太少！
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jiayoubashaonian
2楼2011-12-06 13:44:14
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wskxbxf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-12-06 13:44:14:
基因组DNA双酶切之后，为什么跑电泳什么都看不出来呢?很有可能是楼主的上样量太少！

谢谢回复 我用的是20微升的双酶切体系 DNA加的300ng左右，点样点了10微升 依您看 该点多少呢  求指导 不胜感激
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3楼2011-12-06 16:12:10
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
amisking(金币+3, MolEPI+1): 鼓励积极应助！ 2011-12-06 20:05:34
楼主，我们当时做Southern blot时验证酶切是否完全是这样来的：DNA 浓度20-25ng/ul，酶切过夜后，取6-8ul加上loading buffer，0.8%胶，100V左右跑电泳验证。
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jiayoubashaonian
4楼2011-12-06 17:11:38
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