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wskxbxf

新虫 (小有名气)

[交流] 双酶切 已有1人参与

请大家指点:基因组DNA双酶切之后,为什么跑电泳什么都看不出来呢,上样量是10微升,是因为切完之后浓度太小了吗?还是别的什么原因,在做AFLP,酶切连接之后电泳都没有明显结果,但是做选扩增PCR结果弥散分布在100-1000bp之间,求指点 谢谢各位了
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+3): Good 2011-12-06 22:47:25
引用回帖:
5楼: Originally posted by wskxbxf at 2011-12-06 19:04:10:
哦 那您当时加得几微的DNA做的酶切 用的多大的体系呢,非常感谢了

我们当时是按照DNA量来定的,总量是6ug-10ug左右,200-400ul体系均可,以切成弥散的条带或出现卫星DNA条带为判断依据,蛋白除的干净些,防止回收时有白色的蛋白出来,我们用的NEB的酶,一般切24小时就可以了,中间多离心机次防止蒸发太多水分。
jiayoubashaonian
6楼2011-12-06 19:10:54
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★ ★
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wanhscn(金币+2): 鼓励交流 2011-12-06 14:54:50
基因组DNA双酶切之后,为什么跑电泳什么都看不出来呢?很有可能是楼主的上样量太少!
jiayoubashaonian
2楼2011-12-06 13:44:14
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wskxbxf

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-12-06 13:44:14:
基因组DNA双酶切之后,为什么跑电泳什么都看不出来呢?很有可能是楼主的上样量太少!

谢谢回复 我用的是20微升的双酶切体系 DNA加的300ng左右,点样点了10微升 依您看 该点多少呢  求指导 不胜感激
3楼2011-12-06 16:12:10
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

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amisking(金币+3, MolEPI+1): 鼓励积极应助! 2011-12-06 20:05:34
楼主,我们当时做Southern blot时验证酶切是否完全是这样来的:DNA 浓度20-25ng/ul,酶切过夜后,取6-8ul加上loading buffer,0.8%胶,100V左右跑电泳验证。
jiayoubashaonian
4楼2011-12-06 17:11:38
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