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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

[求助] 液相新手请大家分析一下这个样品图~谢谢了!

本人是一名液相新手,最近才开始学习使用HPLC,之前实验室都是用液相简单的跑一下乙醇,糖类,而我这次需要测的东西是NADH,中文全名为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,即常说的还原型辅酶Ⅰ,查阅了许多文献,根据其中的一篇文献资料进行重复试验.
该文献的色谱分析条件为:
柱条件:Agilent1200series,columnstable-C18(250minx4.6mm)柱。
梯度洗脱条件:0min100%bufferA;10min50%bufferA;11min100%bufferA;15min100%bufferA。
流速1.0mL/min,
检测波长:254nm,340nm。
柱温:35℃。
bufferAH7.0 PBS(磷酸钾缓冲液)

本人所用柱子为inertsil OS-SP(C18)(150minx4.6mm)柱
用标准样品跑了一张如图,大约9min的时候出峰……如图所示
之后提取了酵母胞内的NADH跑了几次,出现的峰非常诡异,从9min开始,基线都开始不稳了……求各位老师分析下,需要改进什么,新手虚心请教!谢谢!

图见附件!!
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  • 附件 1 : NADH标准.bmp
  • 2011-11-27 17:19:11, 949.55 K
  • 附件 2 : 跑出来的图.bmp
  • 2011-11-27 17:19:20, 951.05 K

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foxling2

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

Marado(金币+2): 多谢指点,确实是样品含量比较低,加了一点点标准液,立马峰形好多了. 2011-12-01 09:31:00
引用回帖:
5楼: Originally posted by Marado at 2011-11-28 16:26:23:
补两张放大一点的图……

从这两张放大图来看:

1 样品很脏,需要前处理。因为你的基线在标准中抬高不明显,而样品抬高明显,如果你的样品含量低,这么高的基线都给淹没了。

2 分离度不够。在标准样出峰处一堆子杂峰,需要改进梯度。

3 如果是相同进样体积下,那么样品中含量比标准低几倍的浓度,需要富集。
yyh
7楼2011-11-29 13:11:25
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foxling2

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

在样品中加点标准,看看结果,如果加标样出峰,就可以说明问题了
yyh
2楼2011-11-28 11:03:32
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foxling2

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

还有,你的样品图谱纵坐标应该放大到和标准一样,这样比较才能看出细节的东西
yyh
3楼2011-11-28 11:04:58
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

引用回帖:
2楼: Originally posted by foxling2 at 2011-11-28 11:03:32:
在样品中加点标准,看看结果,如果加标样出峰,就可以说明问题了

如果添加标准跑出了峰是不是说明我样品里面NADH含量过低,或者说根本没有提取出来呢?
我在想,是不是由于文献里面的柱子长度是250,而我的是150的原因?改变一下梯度时间是不是有用呢?
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4楼2011-11-28 16:10:35
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