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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做过用同源重组进行基因敲出的朋友请进，PCR做不出来！！
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xiangquanju

金虫 (小有名气)

[求助] 做过用同源重组进行基因敲出的朋友请进，PCR做不出来！！

利用同源重组的原理，打算敲掉大肠杆菌的一个基因，以pKD4为模板，打算扩增一段带有卡那霉素抗性基因的片段，作为重组筛选的标记。
上下游引物均有70bp，其中20bp是和质粒模板互补的，其余50bp是和基因组上欲敲除的基因互补的。与质粒互补的20bp，Tm值分别为47和60，PCR一直都只有引物带，退火温度从30--50度都试过了，也尝试了pfu和KOD聚合酶，都没什么改进
所以恳请做过类似实验的虫友指点指点
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1楼 2011-11-21 01:18:29
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预防凯凯

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凡子1985 at 2011-11-21 02:48:41
这种PCR一定要注意 主要问题出在模版浓度上 还有问题出现在退火温度上 退火温度选择55°最为保险 主要考虑模版浓度吧  我们是实验室最常做的就是酵母基因的敲除  用的就是这种方法  百试不爽

我想问一个问题行吗，我也是Red同源做缺失的，但一直未成功，我想问，高度保守的序列能够用这种方法缺失一段这样的基因吗，我的是耐药基因，一直转打靶片段，转不进去，不能发生重组，这是什么原因，求助啊
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13楼2014-03-26 14:49:07
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