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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 某基因在某些大麦品系很难扩出的原因
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hqc87

铁虫 (小有名气)

[求助] 某基因在某些大麦品系很难扩出的原因

设计了引物想扩大麦的一个转录因子基因，用的就是基因组DNA做模板来扩增，模板质量经检测没有问题，浓度调整到200ng/ul左右用于扩增的，此基因GC含量70%，加了DMSO还是轻易能扩出，问题是我有八个大麦品种，为什么两个品种条带很弱很弱，其他六个很亮很亮，重复几次还是这样，考虑到引物区在这两个品种中存在SNP的可能性，所以又设计了一对引物，结果扩增结果还是那两个品种很弱，有可能是这两个品系中该基因拷贝少么？还有其他原因么？请各位看官、大虾分析分析

[ Last edited by hqc87 on 2011-11-3 at 21:24 ]
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1楼 2011-11-03 21:22:56
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terry130

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

hqc87(金币+1): 谢谢回复！ 2011-11-16 23:11:02
高GC含量的区域有时会这样的。你可以试试TAKARA的EX taq 配上 GC buffer。这套组合在我们实验室里用来扩高GC含量模板效果蛮好的
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摒气动方息，宁神心自明。
2楼2011-11-16 08:47:12
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hqc87

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by terry130 at 2011-11-16 08:47:12:
高GC含量的区域有时会这样的。你可以试试TAKARA的EX taq 配上 GC buffer。这套组合在我们实验室里用来扩高GC含量模板效果蛮好的

谢谢回复！我在扩增时也加了DMSO 问题是在模板DNA的质量保证都没问题的情况下，为什么6个大麦品种能扩出很强的带，而其他两个品种却很弱很弱？
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3楼2011-11-16 23:09:54
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terry130

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
silicare(金币+3, BioEPI+1): 2011-11-17 12:25:15
hqc87(金币+4): 2011-11-18 05:14:11
引用回帖:
3楼: Originally posted by hqc87 at 2011-11-16 23:09:54:
谢谢回复！我在扩增时也加了DMSO 问题是在模板DNA的质量保证都没问题的情况下，为什么6个大麦品种能扩出很强的带，而其他两个品种却很弱很弱？

既然是不同品种，那片段序列就可能不同啊。
第一点：有时候高GC含量区域并不是简单的加DMSO就能解决的，DMSO的量也有讲究的，而一些复杂二级结构的区域也会造成扩增效果不好，商品化的buffer比你自己加DMSO要好一些，也不贵，就几十块钱而已。TAKARA的GCbuffer就有两种，可见这类buffer的最佳配方要根据情况而定呢。
第二点：既然是不同的品系，那么序列就会有差异，你确定你选择的引物互补序列是绝对保守的吗？？有没有可能那两个品系里引物互补序列发生变化导致不完美互补？？
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摒气动方息，宁神心自明。
4楼2011-11-17 08:58:07
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hqc87

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by terry130 at 2011-11-17 08:58:07:
既然是不同品种，那片段序列就可能不同啊。
第一点：有时候高GC含量区域并不是简单的加DMSO就能解决的，DMSO的量也有讲究的，而一些复杂二级结构的区域也会造成扩增效果不好，商品化的buffer比你自己加DMSO要好 ...

这个我也考虑过引物结合序列存在SNP的可能性，所以重新设计了另一对引物，两对引物的结果都是这两个品种条带很弱，但条带大小和其他品种一样，明天试着把这两个品种的扩增产物做模板进行二次扩增，看能不能得到强的条带 然后克隆测序看看 到底怎么回事，谢谢给我思考这个问题 金币都送给你了 呵呵
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5楼2011-11-18 05:13:29
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