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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 我做连接，总是不成功，能给分析一下原因或有好的方法吗
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上官譞

新虫 (初入文坛)

[求助] 我做连接，总是不成功，能给分析一下原因或有好的方法吗

我做连接，用SwaⅠ酶切，平头末端，用T4连接酶25度反应一小时，总是不成功，能给分析一下原因或有好的方法吗，谢谢
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1楼 2011-09-28 14:20:39
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hgq115

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我现在用的都是快速连接酶16℃1-2小时，T4连接酶很久前用过，但连接时间很长，都是室温过夜的。不知道会不会是你连接时间过短的缘故？
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2楼2011-09-28 16:11:58
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萝卜丝儿

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我用T4一般都是室温过夜连接 都要将近20个小时了
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好好学习，天天向上！
3楼2011-09-28 16:30:28
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yang0071

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2): 鼓励交流~国庆快乐~ 2011-09-30 17:12:17
平端连接本来就效率低很多
建议16度连接过夜
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4楼2011-09-28 16:42:27
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上官譞

新虫 (初入文坛)
лл
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5楼2011-09-29 08:52:50
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laojiu9878

至尊木虫 (知名作家)

九牛

【答案】应助回帖

连接后，4度过夜，效果好些
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但愿人长久
6楼2011-09-29 09:01:00
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linyingjia

至尊木虫 (职业作家)
粘性末端更容易连接
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7楼2011-09-29 14:03:15
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清风寨

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

不到不得已不要用平末端连接  T4连接酶一般连接10h-16h都行
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冷风过心变热
8楼2011-09-29 15:12:15
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bluesea000

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2): 鼓励交流~国庆快乐~ 2011-09-30 17:12:02
上官譞(金币+2): 谢谢分析，我觉得浓度和反应时间可能有问题 2011-10-17 08:16:16
1、我用的是16°连接过夜至少13小时；
2、你可以试试提高片段与质粒的比例到9:1；
3、请确认你的感受态状态是好的，不要用太久以前制备的。
4、平端连接确实效率不太高的。
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9楼2011-09-29 18:18:55
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tdhslxiaoyao

新虫 (小有名气)
呵呵，只做过TA连接，受教
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10楼2011-09-30 10:37:17
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