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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酵母阳性转化子筛选
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wangy0908

金虫 (正式写手)

[求助] 酵母阳性转化子筛选

利用pYES2转化后的酵母细胞，涂板在SD-url培养基上，菌落生长出来后，请问如何筛选其阳性的转化子呢？还是做PCR吗？以及为什么生长出来的菌落很少的呢？我用的是Invitrogen的easy transfromation Kit做的competent cell以及转化。基本上就只有20多个菌落，这样能筛选到阳性的吗？？
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1楼 2011-09-23 09:46:18
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清风寨

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励 2011-09-23 12:36:38
酵母的没做过 大肠杆菌整天做 PCR应该可以吧
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冷风过心变热
2楼2011-09-23 11:24:34
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xiemin217

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+4): 鼓励应助。 2011-09-23 18:30:36
wangy0908(金币+5): xiexie 2011-09-23 21:04:53
wanhscn(金币+2): 鼓励多发帖交流，必要之时将授予专家指数！ 2011-09-24 08:50:33
1.可以涂在2缺，或者更多的板试试
2.20几个实在太少了，我一般做是满板都是，可能的你的转运DNA有问题。
3.酵母感受态状态也很重要的，要新鲜的。
4.PCR是最简单的鉴定方法了
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3楼2011-09-23 17:33:41
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yc652090251

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励应助。 2011-09-23 18:30:40
wangy0908(金币+5): xiexie 2011-09-23 21:05:04
wanhscn(金币+2): 鼓励多发贴交流，必要之时将授予专家指数！ 2011-09-24 08:51:40
wanhscn(金币+5, MolEPI+1): 根据近期表现，经决定，授予阁下专家指数一枚！祝国庆快乐！ 2011-10-03 11:14:05
转化效率太低了，我是用电转的，转化效率很高，另外你的质粒浓度是不是不高啊，另感受态的OD很重要。
一个板20几个菌落的话，直接拿来做菌落PCR，鉴定为阳性的，直接小瓶表达就可以了。
建议先试着做下这几十个表达，同时提高转化效率再进行筛选表达。
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低调做人好么~~
4楼2011-09-23 17:57:34
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wangy0908

金虫 (正式写手)
★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励交流 2011-09-24 08:20:16
引用回帖:
4楼: Originally posted by yc652090251 at 2011-09-23 17:57:34:
转化效率太低了，我是用电转的，转化效率很高，另外你的质粒浓度是不是不高啊，另感受态的OD很重要。
一个板20几个菌落的话，直接拿来做菌落PCR，鉴定为阳性的，直接小瓶表达就可以了。
建议先试着做下这几十个 ...

我不用做蛋白的表达.因为我筛选到阳性后,直接摇菌做重金属的忍耐性分析.但是这样一来少的菌落数,就是不知道能不能筛选到阳性的转化.刚做了PCR,下午才能知道结果.由于是第一次做,就按照说明书这样一来一步一步的来,所以很多地方不清楚.
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5楼2011-09-23 23:38:16
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wangy0908

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xiemin217 at 2011-09-23 17:33:41:
1.可以涂在2缺，或者更多的板试试
2.20几个实在太少了，我一般做是满板都是，可能的你的转运DNA有问题。
3.酵母感受态状态也很重要的，要新鲜的。
4.PCR是最简单的鉴定方法了

这次做的感受态是新鲜的.但是就是不知道他的状态好不的.用的是invitrogen的试剂盒做的.生长出来的菌落是不是大致都应该是阳性的呢??第一次做,太多的不懂了.
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6楼2011-09-23 23:42:53
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