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liweiwei0812

铜虫 (小有名气)

[交流] SNP检测问题 已有3人参与

用HRM方法检测SNP位点，目的片段是否有大小限制？
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1楼 2011-09-13 17:41:51
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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dhd997(金币+10, MolEPI+1): 三楼一起奖励了 2011-09-13 18:09:17
先发个简单介绍

HRM技术服务之SNP检测（snp检测的最佳方案）
单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs），指单个核苷酸碱基的改变，包括置换、颠换、缺失和插入，导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，这就是SNP。SNP在人类基因组中数量较多，发生频率较高，因此被认为是继微卫星之后的新一代遗传学标记。
HRM检测SNP技术是依据在一定的温度范围内将PCR扩增的产物进行变性，期间实时检测体系内荧光信号。荧光值随着温度变化，可绘制溶解曲线。每一段DNA都有其独特的序列，因而也就有了独特的熔解曲线形状，如同DNA指纹图谱一样，具有很高的特异性、稳定性和重复性。根据曲线准确区分野生型纯合子、杂合子和突变性纯合子（下图）。

检测SNP的方法有很多种。成本较低、通量较大的方法大都局限于已知、特定位点，如Taqman探针法。既要对已知位点分析又要查找未知位点，一般采用PCR+测序的方法，成本高、操作繁复较低。

优点（商家宣称）：
作为新一代的遗传扫描工具,HRM技术是一种低成本、高通量、快速，且不受位点局限的检测方法，是SNP筛查的最佳选择。其具有"简、效、快、廉"等其他技术难以比拟的优势:
      简：无需序列特异性探针,不受碱基位点局限,同时检出已知或未知突变、SNP和甲基化位点：闭管操作，避免交叉污染。
      效：最低检测0.1%-0，01%的突变或异常甲基化检测SNP灵敏度和特异性均为100%，。
      快：1次同时不多于384个样本，在60-90分钟内完成检测。
      廉：简化操作步骤、降低人工和试剂成本，费用远少于测序、Taqman探针等方法。
HRM技术特别适用于样本量多、检测位点较少的SNP、突变或甲基化分析，是不同于基因芯片检测方法（检测位点多，样本少）的高通量方法。同时，也是基因芯片筛选后的多个基因在更多标本中验证的最佳方法。




[ Last edited by wanhscn on 2011-9-13 at 18:03 ]
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真相是最大的奢侈品
2楼2011-09-13 17:52:08
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根
★
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关于这项技术的不同声音：

1.HRM技术一个反应只能检测一个片段中的突变，从SNP检测数目上根本不能称为高通量。Illumina的GoldenGate可以同时检测上千个SNP，BeadXpress也能同时检测几百个SNP，Sequenome的MassArray一个反应可以检测20个以上的SNP，Luminex的xTAG也能在一个反应中检测20个甚至更多的SNP。这一点上，HRM没有任何优势；
2.如果说的是样品的高通量，那么以上的技术都有基于96孔板和384孔板的平台，这一点上HRM也没有优势；
3.HRM的结果判断依赖于变性-复性曲线的拟合，每一个片段必须反复摸索，费时费力；而且结果的判断依赖于对照，并不是直接基于核酸序列获得的结果，结果受仪器的状态的影响很大；其精度无法与Sequenome或Luminex、TaqMan等相比。

SNP分析基于不同的目的，应该选用不同的平台：
1.如果是在一个群体中分析大量SNP（几百甚至上千），研究群体遗传结构和进化等，建议选用Ilumina的GoldenGate或BeadXpress；
2.如果检测几十个SNP，建议采用Sequonome的MassArray或Luminex的xTAG;
3.如果只检测少数几个SNP，而样品较多，HRM是一个选择，但不是唯一的选择，TaqMan，Luminex甚至直接测序都可以考虑。

[ Last edited by wanhscn on 2011-9-13 at 18:04 ]
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真相是最大的奢侈品
3楼2011-09-13 17:57:15
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wanhscn

木虫 (职业作家)

哲学@草根
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
有人用 Roter-gene -6000 做HRM来进行基因分型实验,根据做的好的实验，总结经验如下
1，扩增片段小于120
2，要做预实验，一般设计2-3对引物
3，选择扩增效率高，没有引物带的，区分度好的引物，
4，一定要选者标准杂合做为标准基因型，设置为对照。
5，A/T一般做不出来（小于1/5成功）。
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真相是最大的奢侈品
4楼2011-09-13 18:03:11
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a198095

铜虫 (小有名气)
楼上正解啊
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5楼2014-11-30 06:57:29
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18766216190

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by wanhscn at 2011-09-13 18:03:11
有人用 Roter-gene -6000 做HRM来进行基因分型实验,根据做的好的实验，总结经验如下
1，扩增片段小于120
2，要做预实验，一般设计2-3对引物
3，选择扩增效率高，没有引物带的，区分度好的引物，
4，一定要选者标 ...

楼主，用rotor gene q 做snp分型，溶解曲线很多背景杂峰可能是什么原因呀？主峰上也有很多毛刺。
SNP检测问题
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6楼2015-11-10 16:12:22
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