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liweiwei0812铜虫 (小有名气)
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[交流]
SNP检测问题 已有3人参与
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| 用HRM方法检测SNP位点，目的片段是否有大小限制？ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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wanhscn
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先发个简单介绍 HRM技术服务之SNP检测（snp检测的最佳方案） 单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs），指单个核苷酸碱基的改变，包括置换、颠换、缺失和插入，导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，这就是SNP。SNP在人类基因组中数量较多，发生频率较高，因此被认为是继微卫星之后的新一代遗传学标记。 HRM检测SNP技术是依据在一定的温度范围内将PCR扩增的产物进行变性，期间实时检测体系内荧光信号。荧光值随着温度变化，可绘制溶解曲线。每一段DNA都有其独特的序列，因而也就有了独特的熔解曲线形状，如同DNA指纹图谱一样，具有很高的特异性、稳定性和重复性。根据曲线准确区分野生型纯合子、杂合子和突变性纯合子（下图）。 检测SNP的方法有很多种。成本较低、通量较大的方法大都局限于已知、特定位点，如Taqman探针法。既要对已知位点分析又要查找未知位点，一般采用PCR+测序的方法，成本高、操作繁复较低。 优点（商家宣称）： 作为新一代的遗传扫描工具,HRM技术是一种低成本、高通量、快速，且不受位点局限的检测方法，是SNP筛查的最佳选择。其具有"简、效、快、廉"等其他技术难以比拟的优势: 简：无需序列特异性探针,不受碱基位点局限,同时检出已知或未知突变、SNP和甲基化位点：闭管操作，避免交叉污染。 效：最低检测0.1%-0，01%的突变或异常甲基化检测SNP灵敏度和特异性均为100%，。 快：1次同时不多于384个样本，在60-90分钟内完成检测。 廉：简化操作步骤、降低人工和试剂成本，费用远少于测序、Taqman探针等方法。 HRM技术特别适用于样本量多、检测位点较少的SNP、突变或甲基化分析，是不同于基因芯片检测方法（检测位点多，样本少）的高通量方法。同时，也是基因芯片筛选后的多个基因在更多标本中验证的最佳方法。   [ Last edited by wanhscn on 2011-9-13 at 18:03 ] |
2楼2011-09-13 17:52:08
wanhscn
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关于这项技术的不同声音： 1.HRM技术一个反应只能检测一个片段中的突变，从SNP检测数目上根本不能称为高通量。Illumina的GoldenGate可以同时检测上千个SNP，BeadXpress也能同时检测几百个SNP，Sequenome的MassArray一个反应可以检测20个以上的SNP，Luminex的xTAG也能在一个反应中检测20个甚至更多的SNP。这一点上，HRM没有任何优势； 2.如果说的是样品的高通量，那么以上的技术都有基于96孔板和384孔板的平台，这一点上HRM也没有优势； 3.HRM的结果判断依赖于变性-复性曲线的拟合，每一个片段必须反复摸索，费时费力；而且结果的判断依赖于对照，并不是直接基于核酸序列获得的结果，结果受仪器的状态的影响很大；其精度无法与Sequenome或Luminex、TaqMan等相比。 SNP分析基于不同的目的，应该选用不同的平台： 1.如果是在一个群体中分析大量SNP（几百甚至上千），研究群体遗传结构和进化等，建议选用Ilumina的GoldenGate或BeadXpress； 2.如果检测几十个SNP，建议采用Sequonome的MassArray或Luminex的xTAG; 3.如果只检测少数几个SNP，而样品较多，HRM是一个选择，但不是唯一的选择，TaqMan，Luminex甚至直接测序都可以考虑。 [ Last edited by wanhscn on 2011-9-13 at 18:04 ] |
3楼2011-09-13 17:57:15
wanhscn
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