| 查看: 6965 | 回复: 5 | ||||
| 本帖产生 1 个 BioEPI ，点击这里进行查看 | ||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||||
[求助]
蛋白纯化时 NI柱可能进气 如何修复柱子？
|
||||
|
FPLC纯化蛋白 上样的时候 没留意 发现样品管空了 我记得我一分钟以前我发现样品很多的 可能是我进样速度大吧:2.5mL/min 我立刻结束了程序 然后想用水冲 发现系统没压力 然后我拆了柱子 发现柱子上面的管子里面没有液体 然后我用pumpwash 然后想重新上样蛋白 发现系统依然没有压力 然后我就去找一个博士帮忙 博士帮忙用注射器抽了系统的气体 但是他说不确定柱子是否进气 我现在有点担心柱子是否进气 如果进气，如何处理来拯救柱子？ 补充：系统排出气体后，我没有处理柱子，就继续上样了 然后蛋白纯化后 发现样品（猪的蛋白）出峰的位置和我以前做的别的物种（鸡的蛋白）不一样。大峰大概出在第二个和第三个梯度之间，而原来鸡的蛋白的出峰位置在最后一个梯度，而最后一个梯度的时候，这次仅仅是一个小峰。 后来我把这次蛋白纯化的大峰和小峰全部跑SDS-PAGE胶，发现全部都是目的蛋白，都有杂带。但是大峰出的蛋白浓，杂带明显；小峰出的蛋白弱，杂带不明显。（但是有师兄说小峰估计也有杂带，只是因为纯度弱） 为什么要补充这个，是因为有师兄说，如果蛋白跑胶后，有杂带，说明这个柱子柱效就不是很好了。 我不是很懂，所以全部写出来。 希望大家多多帮忙，指出如果进气，柱子会怎样？是否能从蛋白中看出来？ 另外，最重要的是如何修复柱子？ 我有个师姐说用无水乙醇大量冲洗？ 谢谢。 |
回复此楼» 猜你喜欢
生物学学硕求调剂
已经有10人回复
-
上海电力大学材料防护与新材料重点实验室招收调剂研究生（材料、化学、电化学，环境）
已经有4人回复
-
材料学求调剂
已经有6人回复
-
303求调剂
已经有5人回复
-
一志愿武理085500机械专业总分300求调剂
已经有7人回复
-
考研调剂
已经有4人回复
-
281求调剂
已经有4人回复
-
0805 316求调剂
已经有6人回复
-
085601求调剂总分293英一数二
已经有3人回复
-
08工学调剂
已经有17人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 关于用Ni-NTA His.bind树脂纯化原核表达蛋白
已经有16人回复
- 关于带his-tag的膜蛋白镍柱纯化
已经有10人回复
- FPLC蛋白纯化堵柱子？
已经有24人回复
- his标签蛋白纯化，不挂柱
已经有18人回复
- 镍柱纯化蛋白透析出现大量沉淀，请教
已经有18人回复
- Ni柱分离纯化6His标签重组蛋白
已经有23人回复
- 【求助/交流】为什么镍柱纯化可溶性蛋白，电泳结果总是显示不纯呢？
已经有9人回复
- 【求助/交流】镍柱纯化的蛋白保存在-20度一个星期，拿出来都是沉淀？？
已经有19人回复
- 【求助/交流】大家做蛋白纯化的都到什么型号柱子，效果怎么样呢
已经有10人回复
- 【求助/交流】SP柱子纯化蛋白，蛋白结合后，用2M NacL都没有洗脱下来，该怎么办？
已经有5人回复
- 【求助/交流】大家做蛋白纯化时上柱子的缓冲MES需要过膜吗？有机系的还是水系的？
已经有3人回复
- 基因带六个his标签，蛋白纯化时为何挂不上镍柱
已经有26人回复
5楼2018-07-31 18:31:14
a381261023
金虫 (小有名气)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 1901.3
- 散金: 100
- 红花: 1
- 帖子: 169
- 在线: 86.8小时
- 虫号: 1131828
- 注册: 2010-10-25
- 专业: 蛋白质组学
2楼2011-08-29 10:52:02
冼亮淀粉酶
专家顾问 (知名作家)
生物大分子降解酶
-
专家经验: +248 - BioEPI: 73
- 应助: 257 (大学生)
- 贵宾: 0.272
- 金币: 19462.4
- 散金: 1704
- 红花: 121
- 帖子: 6587
- 在线: 2777.8小时
- 虫号: 856414
- 注册: 2009-09-25
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
- 管辖: 微生物
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
lstt09nk(金币+8, BioEPI+1): 感谢交流 2011-08-29 17:05:27
左旋安菲(金币+90): 谢谢 我的镍柱是预装柱 好像不透明 我们用的fplc是GE公司的，好像也是AKTK的。不过我后来已经把这个柱子继续上样 纯化蛋白了 我回头再看一下吧 2011-08-31 01:51:03
lstt09nk(金币+8, BioEPI+1): 感谢交流 2011-08-29 17:05:27
左旋安菲(金币+90): 谢谢 我的镍柱是预装柱 好像不透明 我们用的fplc是GE公司的，好像也是AKTK的。不过我后来已经把这个柱子继续上样 纯化蛋白了 我回头再看一下吧 2011-08-31 01:51:03
|
镍柱是亲和层析，6个组氨酸标签，但是也不一定都没有杂带的，多多少少都会有，一步就到95%纯度极其艰难，这跟柱效关系不大。如果觉得不够纯，就用第一次纯化之后的蛋白质作为样品进行第二次纯化，会比第一次纯化之后更纯一些，但纯度能达到什么程度也是运气问题。 你的镍柱是预装柱？装填料的容器不是透明的？如果是透明的，填料进了气泡之后，填料之间的空隙会比没有空隙的地方白，一眼就看出来了。 因为你是在上样品的时候进空气，所以你应该用上样缓冲液来冲洗，最好别用20%乙醇，因为层析柱的溶剂更换有个原则，就是要确保溶剂之间不要起反应，所以进空气的时候溶剂能不换就最好不换，因为样品所处的起始液和20%乙醇是不同的。你用起始液冲洗10个柱床体积之后，空气应该就差不多跑掉了，可以正常洗脱了。 我用AKTA如果进了空气很容易处理，因为管道都是透明的，不知道FPLC的管道是不是透明的。FPLC说是流速更大，更耐压，其实层析的时候流速太大对蛋白质分离是极其不利的。 我用AKTA得出的结论，你权衡一下，合适就用，不合适就别用。 |
3楼2011-08-29 16:23:41
4楼2017-10-26 21:54:34
