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左旋安菲专家顾问
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蛋白纯化时 NI柱可能进气 如何修复柱子？
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FPLC纯化蛋白 上样的时候 没留意 发现样品管空了 我记得我一分钟以前我发现样品很多的 可能是我进样速度大吧:2.5mL/min 我立刻结束了程序 然后想用水冲 发现系统没压力 然后我拆了柱子 发现柱子上面的管子里面没有液体 然后我用pumpwash 然后想重新上样蛋白 发现系统依然没有压力 然后我就去找一个博士帮忙 博士帮忙用注射器抽了系统的气体 但是他说不确定柱子是否进气 我现在有点担心柱子是否进气 如果进气，如何处理来拯救柱子？ 补充：系统排出气体后，我没有处理柱子，就继续上样了 然后蛋白纯化后 发现样品（猪的蛋白）出峰的位置和我以前做的别的物种（鸡的蛋白）不一样。大峰大概出在第二个和第三个梯度之间，而原来鸡的蛋白的出峰位置在最后一个梯度，而最后一个梯度的时候，这次仅仅是一个小峰。 后来我把这次蛋白纯化的大峰和小峰全部跑SDS-PAGE胶，发现全部都是目的蛋白，都有杂带。但是大峰出的蛋白浓，杂带明显；小峰出的蛋白弱，杂带不明显。（但是有师兄说小峰估计也有杂带，只是因为纯度弱） 为什么要补充这个，是因为有师兄说，如果蛋白跑胶后，有杂带，说明这个柱子柱效就不是很好了。 我不是很懂，所以全部写出来。 希望大家多多帮忙，指出如果进气，柱子会怎样？是否能从蛋白中看出来？ 另外，最重要的是如何修复柱子？ 我有个师姐说用无水乙醇大量冲洗？ 谢谢。 |
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2楼2011-08-29 10:52:02
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【答案】应助回帖
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lstt09nk(金币+8, BioEPI+1): 感谢交流 2011-08-29 17:05:27
左旋安菲(金币+90): 谢谢 我的镍柱是预装柱 好像不透明 我们用的fplc是GE公司的，好像也是AKTK的。不过我后来已经把这个柱子继续上样 纯化蛋白了 我回头再看一下吧 2011-08-31 01:51:03
lstt09nk(金币+8, BioEPI+1): 感谢交流 2011-08-29 17:05:27
左旋安菲(金币+90): 谢谢 我的镍柱是预装柱 好像不透明 我们用的fplc是GE公司的，好像也是AKTK的。不过我后来已经把这个柱子继续上样 纯化蛋白了 我回头再看一下吧 2011-08-31 01:51:03
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镍柱是亲和层析，6个组氨酸标签，但是也不一定都没有杂带的，多多少少都会有，一步就到95%纯度极其艰难，这跟柱效关系不大。如果觉得不够纯，就用第一次纯化之后的蛋白质作为样品进行第二次纯化，会比第一次纯化之后更纯一些，但纯度能达到什么程度也是运气问题。 你的镍柱是预装柱？装填料的容器不是透明的？如果是透明的，填料进了气泡之后，填料之间的空隙会比没有空隙的地方白，一眼就看出来了。 因为你是在上样品的时候进空气，所以你应该用上样缓冲液来冲洗，最好别用20%乙醇，因为层析柱的溶剂更换有个原则，就是要确保溶剂之间不要起反应，所以进空气的时候溶剂能不换就最好不换，因为样品所处的起始液和20%乙醇是不同的。你用起始液冲洗10个柱床体积之后，空气应该就差不多跑掉了，可以正常洗脱了。 我用AKTA如果进了空气很容易处理，因为管道都是透明的，不知道FPLC的管道是不是透明的。FPLC说是流速更大，更耐压，其实层析的时候流速太大对蛋白质分离是极其不利的。 我用AKTA得出的结论，你权衡一下，合适就用，不合适就别用。 |
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