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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 定量PCR求助！急！
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leon198418029

金虫 (小有名气)

research associate

[求助] 定量PCR求助！急！

使用定量PCR可以进行SNP分析，原理为TAQMAN探针中若有一处碱基与模板链不互补，即不能结合进而水解产生荧光。
利用此原理，我设计了特异鉴定某种藻类的TAQMAN探针。由于另一种亲缘关系极近的藻类的存在（我使用的是保守区域，ITS及其中间的5.8S rDNA区域，此处相似度达99%。另外18S，28S相似度也极高），设计此探针颇为费事。不过最终在此区域中找到一处碱基不同的地方，其两侧也适合设计定量PCR引物。本以为可以借鉴SNP的做法，达到特异鉴定目标藻的目的，但是，实验中还是会对另一种藻产生扩增，只是Ct值出现较晚，在30以后。不过，这已经影响到我特异鉴定目标藻的目的。
现在不明白的是，既然SNP可以做到单碱基突变，探针即可不结合，为何在我这里不行？我也听说过有同学在探针有一处碱基不匹配的情况下可以进行扩增的情况。那么到底探针在有一碱基不匹配的情况下，究竟是否能反应？
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不忘初心，为梦远行。
1楼 2011-08-14 19:53:33
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love_st

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-08-14 20:37:07
虽然宣传是那样的，你的那点变异是在哪儿，如果在3‘后，那肯定也会有切割，就会有信号了，用一些高保真的酶试试
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2楼2011-08-14 19:55:19
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leon198418029

金虫 (小有名气)

research associate
引用回帖:
2楼: Originally posted by love_st at 2011-08-14 19:55:19:
虽然宣传是那样的，你的那点变异是在哪儿，如果在3‘后，那肯定也会有切割，就会有信号了，用一些高保真的酶试试

3‘后？探针的吗？我的变异位点在中间位置吧。
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不忘初心，为梦远行。
3楼2011-08-14 19:59:41
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love_st

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

leon198418029(金币+3): 谢谢交流！我觉得确实单点突变很难做到不扩增。 2011-08-14 20:03:06
taqman MGB的试过没，一个点突变的确实很难保证不同时扩增
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4楼2011-08-14 20:01:30
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leon198418029

金虫 (小有名气)

research associate
引用回帖:
4楼: Originally posted by love_st at 2011-08-14 20:01:30:
taqman MGB的试过没，一个点突变的确实很难保证不同时扩增

如果探针与模板相比，少了一个碱基，会不会也不影响扩增？
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不忘初心，为梦远行。
5楼2011-08-14 20:04:36
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love_st

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): 鼓励热心 2011-08-15 13:17:01
引用回帖:
5楼: Originally posted by leon198418029 at 2011-08-14 20:04:36:
如果探针与模板相比，少了一个碱基，会不会也不影响扩增？

你看在哪儿了，探针是从5’开始切割的，如果在前头的话我想有可能会不扩增
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6楼2011-08-14 20:26:45
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-08-15 11:25:41
leon198418029(金币+3): 虽然我不做SNP，但是你的讲解很具体！多谢！ 2011-08-15 18:48:27
leon198418029(金币+4): 长见识了！谢谢！ 2011-08-17 18:00:17
西瓜(金币+3, MolEPI+1): 补上！学习了！ 2011-08-18 01:28:35
如果是SNP分型的话，你可以设计blocker，让blocker与你的引物竞争性地与模板结合，可以减少错配率。
blocker的序列跟引物只在序列变异的碱基处不同，即与野生株的模板序列是相同的，另外blocker在3‘端连有PO4基团，这样可以对错配起到阻滞作用。你可以查一下这方面的文献。
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7楼2011-08-15 09:34:50
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风的呢喃

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我觉得一个碱基的话使用高保真酶是可以扩增的， 你可以试一试……顺便问下楼主，我也在提蓝藻的RNA，但方法都不是很好，请问你们使用什么方法提的？方便的话可联系我：zhangauwind@mail.ahnu.edn.cn
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8楼2011-08-16 17:42:36
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leon198418029

金虫 (小有名气)

research associate
引用回帖:
8楼: Originally posted by 风的呢喃 at 2011-08-16 17:42:36:
我觉得一个碱基的话使用高保真酶是可以扩增的， 你可以试一试……顺便问下楼主，我也在提蓝藻的RNA，但方法都不是很好，请问你们使用什么方法提的？方便的话可联系我：zhangauwind@mail.ahnu.edn.cn

不好意思，我只提取DNA.
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不忘初心，为梦远行。
9楼2011-08-17 18:00:51
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