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anlewo7777

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3, MolEPI+1): 方法二很新颖 2011-07-26 22:48:21
我以前也遇到过这种情况,有两个办法:一个是,按原来的体系多做点,合并之后切胶回收,这样得到你的目标条带;另一个是配100ul的体系,模板用注射器针头在做好的目标条带位置扎一下,用针筒吹进PCR体系里作为模板,同时降低退火温度扩增一下试试。这两个方法你可以试试看哪个可以走通。另外,有必要仔细检查一下你的两端引物是不是对,别弄错了。
2楼2011-07-26 22:06:33
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金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3, MolEPI+1): 重组PCR是做出来了,但是再扩增就没有了呢。降低退火温度和换方法都可以考虑。 2011-07-26 22:50:09
你的B基因扩完后有两条非常量的带,不知道你的A,B基因以及B图中扩出来的片段各是多大?至于重组PCR没扩出目的条带给你的建议是:
(1)检查overlap有多长,最好在15bp以上,能达到20bp就更好了
(2)选取你扩A,B基因时最低的那个退火温度来扩增
(3)如果两个方案都不行设计酶切连接方案,在A片段的3‘末端和B片段的5’端(以A在前B在后为例)添加BbsI酶切位点(先看看这个酶怎么用,看懂了再设计,实在看不懂问我),先将两个片段分别连载体,测序正确后再将A装B或B装A
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3楼2011-07-26 22:41:25
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