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lemonilove银虫 (小有名气)
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[求助]
重组PCR验证时没有目的条带
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进行基因A和基因B进行重组PCR后，琼脂糖核酸电泳发现存在目的条带，但是也有很多非特异性的条带，切胶回收后用距离最远的两端的引物PCR验证，核酸电泳后只在100-250bp之间有很亮的条带，而目标位置没有条带，求解决办法! A基因  B基因  重组PCR验证  [ Last edited by lemonilove on 2011-7-26 at 21:59 ] |
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 【分子生物】EPI帖 |
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anlewo7777
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2楼2011-07-26 22:06:33
空谷幽风
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【答案】应助回帖
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西瓜(金币+3, MolEPI+1): 重组PCR是做出来了，但是再扩增就没有了呢。降低退火温度和换方法都可以考虑。 2011-07-26 22:50:09
西瓜(金币+3, MolEPI+1): 重组PCR是做出来了，但是再扩增就没有了呢。降低退火温度和换方法都可以考虑。 2011-07-26 22:50:09
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你的B基因扩完后有两条非常量的带，不知道你的A,B基因以及B图中扩出来的片段各是多大？至于重组PCR没扩出目的条带给你的建议是： （1）检查overlap有多长，最好在15bp以上，能达到20bp就更好了 （2）选取你扩A,B基因时最低的那个退火温度来扩增 （3）如果两个方案都不行设计酶切连接方案，在A片段的3‘末端和B片段的5’端（以A在前B在后为例）添加BbsI酶切位点（先看看这个酶怎么用，看懂了再设计，实在看不懂问我），先将两个片段分别连载体，测序正确后再将A装B或B装A |
3楼2011-07-26 22:41:25
kun2199
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4楼2011-07-31 22:59:26
10