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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重组PCR验证时没有目的条带
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lemonilove

银虫 (小有名气)

[求助] 重组PCR验证时没有目的条带

进行基因A和基因B进行重组PCR后，琼脂糖核酸电泳发现存在目的条带，但是也有很多非特异性的条带，切胶回收后用距离最远的两端的引物PCR验证，核酸电泳后只在100-250bp之间有很亮的条带，而目标位置没有条带，求解决办法!
A基因

B基因

重组PCR验证


[ Last edited by lemonilove on 2011-7-26 at 21:59 ]
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1楼 2011-07-26 21:50:34
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anlewo7777

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3, MolEPI+1): 方法二很新颖 2011-07-26 22:48:21
我以前也遇到过这种情况，有两个办法：一个是，按原来的体系多做点，合并之后切胶回收，这样得到你的目标条带；另一个是配100ul的体系，模板用注射器针头在做好的目标条带位置扎一下，用针筒吹进PCR体系里作为模板，同时降低退火温度扩增一下试试。这两个方法你可以试试看哪个可以走通。另外，有必要仔细检查一下你的两端引物是不是对，别弄错了。
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2楼2011-07-26 22:06:33
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3, MolEPI+1): 重组PCR是做出来了，但是再扩增就没有了呢。降低退火温度和换方法都可以考虑。 2011-07-26 22:50:09
你的B基因扩完后有两条非常量的带，不知道你的A,B基因以及B图中扩出来的片段各是多大？至于重组PCR没扩出目的条带给你的建议是：
（1）检查overlap有多长，最好在15bp以上，能达到20bp就更好了
（2）选取你扩A,B基因时最低的那个退火温度来扩增
（3）如果两个方案都不行设计酶切连接方案，在A片段的3‘末端和B片段的5’端（以A在前B在后为例）添加BbsI酶切位点（先看看这个酶怎么用，看懂了再设计，实在看不懂问我），先将两个片段分别连载体，测序正确后再将A装B或B装A
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
3楼2011-07-26 22:41:25
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kun2199

金虫 (小有名气)
楼上虫友是不是通过Bbs1这个酶将两个片段和载体一起做三连接。
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4楼2011-07-31 22:59:26
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