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rollandyoung

金虫 (小有名气)

[求助] 关于质粒pCAMBIA1301的验证

别人送了我一个pCAMBIA1301的质粒，不知道如何验证其可用性。
一、我做了如下工作：
1. 将带有该质粒的大肠杆菌菌液划线于LB平板上，平板上含有50ug/ml的潮霉素（此质粒具有抗潮霉素的基因）
2. 37℃培养16小时，结果每个平板上只有2-3个菌落出现。
二、问题：
1. 请问这是正常的吗？
2.菌落数量稀少是否与我加入的潮霉素含量过高有关？
3. 为了鉴定此质粒的可用性，我还需要做哪些工作？
此质粒是开展实验的基础，且以前从未接触过此类试验，顾求知欲望急切，请各位高手不吝赐教，先行谢过大家！
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1楼 2011-07-26 10:46:32
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木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by rollandyoung at 2011-07-26 10:46:32:
别人送了我一个pCAMBIA1301的质粒，不知道如何验证其可用性。
一、我做了如下工作：
1. 将带有该质粒的大肠杆菌菌液划线于LB平板上，平板上含有50ug/ml的潮霉素（此质粒具有抗潮霉素的基因）
2. 37℃培养16小时 ...

对了，这个质粒具有卡那抗性，在构建载体时我们一般在培养基里加入卡纳抗生素，挑取单克隆，摇菌然后利用潮霉素引物扩增验证。
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3楼2011-07-26 11:16:57
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木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
rollandyoung(金币+2): 非常感谢你的帮助，很详细！祝你试验顺利！ 2011-07-26 12:18:55
dhd997(金币+2): 鼓励一下 2011-07-26 12:59:09
引用回帖:
Originally posted by rollandyoung at 2011-07-26 10:46:32:
别人送了我一个pCAMBIA1301的质粒，不知道如何验证其可用性。
一、我做了如下工作：
1. 将带有该质粒的大肠杆菌菌液划线于LB平板上，平板上含有50ug/ml的潮霉素（此质粒具有抗潮霉素的基因）
2. 37℃培养16小时 ...

1. 可以根据pCAMBIA1301的图谱进行酶切验证，如利用XhoI酶切则把潮霉素基因切下来获得对应的片段，
2. 利用35S启动子等设计引物测序，这个质粒应该是11837bp，序列也都公布了，直接比对就可以了。
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2楼2011-07-26 11:14:43
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励应助 2011-07-26 20:29:09
1：可以进行测序的；
2：将带有该质粒的大肠杆菌划线到平板上，提质粒，然后根据该载体上图谱进行双酶切或者单酶切进行验证；这个方法比较保险；
其实要检验此载体的可用性，即便在该抗生素的板子上生长也不能说明什么问题；看你要做什么实验了，如果可以达到预期的目的那么就可用；
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2011-07-26 14:25:32
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czfscf

金虫 (正式写手)
楼主你好，我想做个农杆菌介导真菌，想问您要这个pCAMBIA1301质粒，求赠送或者交换，邮费我这边付。购买也行！万分感激，读个研不易啊
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Ecological Genomics；the scientific walking hormone
5楼2013-05-03 14:17:41
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