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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 9k表达质粒 电转化km71
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qwky2010

金虫 (著名写手)

[求助] 9k表达质粒 电转化km71

大家好，我用的是pPIC9k表达质粒 电转化km71之后是涂什么平板筛选重组子呢，谢谢了,　我之前涂的是YPD+G418 ,看文献怎么是MM之类 ，不知做何选择

[ Last edited by qwky2010 on 2011-7-24 at 10:18 ]
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天道酬勤
1楼 2011-07-24 10:17:36
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cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+6, EPI+1): 鼓励应助 2011-07-24 19:27:59
楼主没说用于真核或原核，。。
仔细查了一下
卡那能结合细菌核糖体的30S亚基上的16S rRNA，干扰formyl-methionyl-tRNA 与30SrRNA的连接，阻断细菌蛋白质的合成，对真核作用不大，真不到筛选的作用。

看宿主了，宿主是原核的用kana，是真核的话用G418

dxy上查了查，下面这个比较专业，一起学习之
一般卡那霉素抗性基因编码的是新霉素磷酸转移酶II，基因记做neo，能通过降解G418、新霉素和卡那霉素来实现真核和原核细胞的相应抗性，这个酶在基因工程中是比较特殊的，既可以再原核生物中表达使大肠杆菌等表现出卡那霉素抗性，也可以再真核生物中表达使动植物细胞表现出G418抗性。因为卡那霉素对真核生物没什么作用，所以一般应用于原核生物就是卡那霉素抗性基因，应用于真核生物就是G418抗性。如果需要在原核生物中应用，必须要加上原核生物对应宿主的启动子，为大肠杆菌设计的卡那抗性基因一般因启动子不通用，难以在革兰氏阳性菌和其他亲缘关系较远的宿主中表现出卡那霉素抗性。而如果需要在真核生物中使用，则必须加上相应受体中能发挥作用的启动子，如需要在酵母中用G418筛选则需要加上酵母的启动子，如果需要在哺乳动物细胞中使用G418筛选则需要加上哺乳动物细胞启动子等等。所以载体直接决定在目的细胞中是否能表达该基因，是否能表现相应的抗性。当然，真核生物中选择G418，原核生物中选择卡那霉素。
为原核生物表达所设计的表达载体如pET28a，其neo基因启动子只能在大肠杆菌等革兰氏阴性菌中启动抗性基因的表达，是不能在真核生物中用于G418抗性筛选的。同样，比如用于酵母表达的载体pPIC9K，携带一个氨苄抗性基因，同时携带的neo基因能在酵母中启动也能在大肠杆菌中启动，故可用于重组酵母G418筛选和大肠杆菌卡那霉素筛选，但同样也不能用于在哺乳动物细胞中的G418筛选。而pIRES2中只有一个neo抗性基因，但是既能在大肠杆菌中启动也能在哺乳动物细胞中启动，故而可用于大肠杆菌卡那霉素抗性筛选和哺乳动物细胞G418筛选，但是不能用于酵母等其他真核生物的G418抗性筛选。
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qwky2010
7楼2011-07-24 12:03:33
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cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

qwky2010(金币+10): 谢谢你，不过这个载体的说明书上提供的是g418筛选的呀，我就不懂了，请指点，谢谢 2011-07-24 10:47:31
amisking: 2011-07-24 19:27:42
http://blog.sina.com.cn/s/blog_6007f6d00100i0el.html
质粒图谱中并无neo抗性位点，用g418筛选没用

可以用amp 蓝白斑法筛选
或者用卡那霉素筛选
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2楼2011-07-24 10:43:10
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qwky2010

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by cdl007 at 2011-07-24 10:43:10:
http://blog.sina.com.cn/s/blog_6007f6d00100i0el.html
质粒图谱中并无neo抗性位点，用g418筛选没用

可以用amp 蓝白斑法筛选
或者用卡那霉素筛选

为所提及的筛选：Spot 10 μl from each well on YPD plates containing Geneticin® at a final concentration of 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.5, 1.75, 2.0, 3.0, and 4.0 mg/ml. Spot in a regular pattern using the multi-channel pipette or a grid underneath the plate.
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天道酬勤
3楼2011-07-24 10:51:00
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

qwky2010(金币+10): 谢谢啦 我见文献有用MM平板筛选的，到底哪个好些呢 2011-07-24 10:59:32
amisking: 2011-07-24 19:27:48
楼上说的不完全正确！
pPIC9k转大肠杆菌是用卡那霉素筛选，转酵母就不能用卡那霉素筛选，只能用G418抗性筛选（原因是一个是原核生物一个是真核生物，有效的抗生素不一样），，而且还可以用不同浓度G418筛选多拷贝转化子。
电转化之后筛选重组子用YPD+G418事可以的。
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4楼2011-07-24 10:54:58
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