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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT后扩增到的条带出现非特异性，该如何处理
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wkl1984

金虫 (小有名气)

[求助] RT后扩增到的条带出现非特异性，该如何处理

做完RT后，进行PCR，结果又非特异性条带出现，同时好像有很多弥散。请大家帮忙分析，用的是PCR Mix扩增的，条带大致在300-400之间，可是出现的条带在100附近了，请求分析。
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1楼 2011-07-19 23:37:39
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逍遥狂骑

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
dhd997(金币+1): 鼓励 2011-07-25 08:14:02
wkl1984(金币+50): 1 2011-07-31 12:43:17
要提高退火温度吧，增强特异性
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2楼2011-07-24 17:02:07
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-07-25 08:14:13
没有目的条带，100bp的条带有可能是引物二聚体哦，降低一下退火温度，再扩不出来就重新设计引物吧
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
3楼2011-07-24 17:39:11
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12zhangwei

新虫 (小有名气)
★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-07-25 08:14:24
如果只是扩增某个基因，在300-400bp有你想要的条带先连载体测序一下，有点非特异扩增也没关系。要是没有你的目的条带认真看设计的引物，blast一下，或调整退火温度
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4楼2011-07-24 20:33:36
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icosahedron

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-07-25 16:07:11
1 是否目的基因的浓度太低，以至于扩不出来？用个内参引物验证下cDNA的质量。

2 引物的问题，有时候引物不对劲，横劈竖劈就是不出来，只能重新设计引物了。

3 PCR体系的问题？没有找到最适扩增条件，可以尝试做梯度PCR，以及更改Mg离子浓度。

4 第二种情况的可能性最大。
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愚公移山
5楼2011-07-25 12:48:49
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