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求助DNA提取方法
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| 本人最近用微波法提细菌DNA，提了几天都毫无结果，想问一下大虾们有什么好的方法，我提DNA主要是用于16rDNA扩增，然后进行测序鉴定菌种的 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): 2011-07-06 07:42:38
dhd997(金币+5, EPI+1): 2011-07-06 07:42:38
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发上来的时候有的出现了乱码，重发一次，有些单位用汉字打 2.10.1.1染色体总DNA少量提取 （1） 取过夜培养菌液1.5毫升于2.0毫升EP管中，9000rpm离心2min，弃上清，收集菌体，吸干水分； （2） 对G+菌株加100微克/毫升溶菌酶50微升，30℃处理1h； （3） 裂解：向每管加200微升裂解缓冲液（40毫摩尔/升 Tris-HCl，毫摩尔/升乙酸钠，1摩尔/升 EDTA，1% SDS，pH8.0），迅速剧烈抽吸悬浮菌体，使其裂解； （4） 加入66微升5摩尔/升NaCl，充分混匀，12000rpm离心10min，沉淀蛋白及细胞壁； （5） 收集上清液，用等体积苯酚抽提，12000rpm离心10min；（也可尝试用苯酚/氯仿） （6） 收集上清液，加入与上清液等体积的氯仿:异戊醇（24:1），混匀，12000 rpm离心10 min； （7） 取上清液加入2倍体积无水乙醇，温和颠倒，13000 rpm离心15 min； （8） 弃上清，沉淀物用1毫升75%的乙醇冲洗2-3次，真空干燥器干燥总DNA沉淀； （9） 基因组DNA沉淀用30微升TE 或ddH2O溶解。并进行琼脂糖核酸电泳，检验大小及浓度，-20℃储存。 要是你不知道是不是G+，那还是加吧。 |
7楼2011-07-06 00:22:00
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-07-05 19:17:12
1949stone:编辑内容 2011-07-05 19:42
1949stone:编辑内容 2011-07-05 19:43
追梦的人1987(金币+1): 2011-07-05 22:20:20
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-07-05 19:17:12
1949stone:编辑内容 2011-07-05 19:42
1949stone:编辑内容 2011-07-05 19:43
追梦的人1987(金币+1): 2011-07-05 22:20:20
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2.10.1.1染色体总DNA少量提取 （1） 取过夜培养菌液1.5ml于2.0ml EP管中，9000rpm离心2min，弃上清，收集菌体，吸干水分； （2） 对G+菌株加100g/ml溶菌酶50l，30℃处理1h； （3） 裂解：向每管加200l裂解缓冲液（40mmol/L Tris-HCl，20mmol/L 乙酸钠，1mol/L EDTA，1% SDS，pH8.0），迅速剧烈抽吸悬浮菌体，使其裂解； （4） 加入66l 5mol/L NaCl，充分混匀，12000rpm离心10min，沉淀蛋白及细胞壁； （5） 收集上清液，用等体积苯酚/氯仿抽提，12000rpm离心10min （6） 收集上清液，加入与上清液等体积的氯仿:异戊醇（24:1），混匀，12000 rpm离心10 min； （7） 取上清液加入2倍体积无水乙醇，温和颠倒，13000 rpm离心15 min； （8） 弃上清，沉淀物用1ml 75%的乙醇冲洗2-3次，真空干燥器干燥总DNA沉淀； （9） 基因组DNA沉淀用30 μl TE 或ddH2O溶解。并进行琼脂糖核酸电泳，检验大小及浓度，-20℃储存。 [ Last edited by 1949stone on 2011-7-5 at 19:43 ] |
2楼2011-07-05 19:03:10
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