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追梦的人1987

金虫 (小有名气)

[求助] 求助DNA提取方法

本人最近用微波法提细菌DNA，提了几天都毫无结果，想问一下大虾们有什么好的方法，我提DNA主要是用于16rDNA扩增，然后进行测序鉴定菌种的
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1楼 2011-07-05 17:36:41
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-07-05 19:17:12
1949stone:编辑内容 2011-07-05 19:42
1949stone:编辑内容 2011-07-05 19:43
追梦的人1987(金币+1): 2011-07-05 22:20:20
2.10.1.1染色体总DNA少量提取
（1） 取过夜培养菌液1.5ml于2.0ml EP管中，9000rpm离心2min，弃上清，收集菌体，吸干水分；
（2） 对G+菌株加100g/ml溶菌酶50l，30℃处理1h；
（3） 裂解：向每管加200l裂解缓冲液（40mmol/L Tris-HCl，20mmol/L 乙酸钠，1mol/L EDTA，1% SDS，pH8.0），迅速剧烈抽吸悬浮菌体，使其裂解；
（4） 加入66l 5mol/L NaCl，充分混匀，12000rpm离心10min，沉淀蛋白及细胞壁；
（5） 收集上清液，用等体积苯酚/氯仿抽提，12000rpm离心10min
（6） 收集上清液，加入与上清液等体积的氯仿:异戊醇（24:1），混匀，12000 rpm离心10 min；
（7） 取上清液加入2倍体积无水乙醇，温和颠倒，13000 rpm离心15 min；
（8） 弃上清，沉淀物用1ml 75%的乙醇冲洗2-3次，真空干燥器干燥总DNA沉淀；
（9） 基因组DNA沉淀用30 μl TE 或ddH2O溶解。并进行琼脂糖核酸电泳，检验大小及浓度，-20℃储存。

[ Last edited by 1949stone on 2011-7-5 at 19:43 ]
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2011-07-05 19:03:10
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★
1949stone(金币+1): 在楼上修改了 2011-07-05 19:43:02
（5） 收集上清液，用等体积苯酚/氯仿抽提，12000rpm离心10min；
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3楼2011-07-05 19:09:28
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追梦的人1987

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-07-05 19:03:10:
2.10.1.1染色体总DNA少量提取
（1） 取过夜培养菌液1.5ml于2.0ml EP管中，9000rpm离心2min，弃上清，收集菌体，吸干水分；
（2） 对G+菌株加100g/ml溶菌酶50l，30℃处理1h；
（3） 裂解：向每 ...

我想问一下第五步是什么意思啊
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4楼2011-07-05 22:22:07
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
蛋白质不能一步就去除完的
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5楼2011-07-05 22:44:36
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追梦的人1987

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-07-05 22:44:36:
蛋白质不能一步就去除完的

问错了，我想问一下第四步加入66l 5mol/L NaCl，充分混匀，12000rpm离心10min，沉淀蛋白及细胞壁；
是15mol/L吗，还有，如果不知道是不是阳性菌的话，还需要加溶菌酶吗
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6楼2011-07-05 23:19:02
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): 2011-07-06 07:42:38
发上来的时候有的出现了乱码，重发一次，有些单位用汉字打

2.10.1.1染色体总DNA少量提取
（1） 取过夜培养菌液1.5毫升于2.0毫升EP管中，9000rpm离心2min，弃上清，收集菌体，吸干水分；
（2） 对G+菌株加100微克/毫升溶菌酶50微升，30℃处理1h；
（3） 裂解：向每管加200微升裂解缓冲液（40毫摩尔/升 Tris-HCl，毫摩尔/升乙酸钠，1摩尔/升 EDTA，1% SDS，pH8.0），迅速剧烈抽吸悬浮菌体，使其裂解；
（4） 加入66微升5摩尔/升NaCl，充分混匀，12000rpm离心10min，沉淀蛋白及细胞壁；
（5） 收集上清液，用等体积苯酚抽提，12000rpm离心10min；（也可尝试用苯酚/氯仿）
（6） 收集上清液，加入与上清液等体积的氯仿:异戊醇（24:1），混匀，12000 rpm离心10 min；
（7） 取上清液加入2倍体积无水乙醇，温和颠倒，13000 rpm离心15 min；
（8） 弃上清，沉淀物用1毫升75%的乙醇冲洗2-3次，真空干燥器干燥总DNA沉淀；
（9） 基因组DNA沉淀用30微升TE 或ddH2O溶解。并进行琼脂糖核酸电泳，检验大小及浓度，-20℃储存。

要是你不知道是不是G+，那还是加吧。
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7楼2011-07-06 00:22:00
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追梦的人1987

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-07-06 00:22:00:
发上来的时候有的出现了乱码，重发一次，有些单位用汉字打

2.10.1.1染色体总DNA少量提取
（1） 取过夜培养菌液1.5毫升于2.0毫升EP管中，9000rpm离心2min，弃上清，收集菌体，吸干水分；
（2） 对G+菌株加100 ...

Tris-Hcl的pH值是多少啊
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8楼2011-07-06 08:06:01
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★
西瓜(金币+1): 热心 2011-07-06 16:57:58
整个裂解缓冲液的pH为8.0
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9楼2011-07-06 16:15:45
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快乐酒僧

新虫 (小有名气)
借个宝地大侠们也帮我分析一下呗，四种菌做的平行 用试剂盒提的结果也这么糟糕么 只能期望PCR有好的结果了。。。

DNA提取验证图 4yue 3.jpg
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10楼2013-04-05 22:47:42
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