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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » 测序结果的疑问
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shizishanshang

至尊木虫 (职业作家)

[交流] 测序结果的疑问

前面利用CODEHOPE设计了简并引物，克隆一个基因片段。现在测序结果已经出来，令我很疑惑。

割胶回收后连接PMD18载体后，涂平板，挑单菌过夜摇菌，之后提质粒酶切，送去测序。

现在问题来了，同一个平板出来的克隆，测序结果不同，有80%左右的相似性。BLAST后都与相关基因具有比较高的同源性。

现在一共送去了11个克隆测序，目前粗粗看了一下至少有4个不同的片段，之间一般是具有80%左右的同源性。

请问这是怎么回事？基因家族？我要克隆的这个基因是具有基因家族的传统的，拟南芥等植物里一般有4-8个基因家族是很正常的。 还是测序问题？

令外问一个令我不解的问题，植物的基因组应该是固定的吧，那么那么多基因家族，对应的外显子应该不同，怎么能一一对应基因组DNA呢？

望大家解惑，谢谢！
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1楼2011-07-05 09:49:13
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thinka

铜虫 (著名写手)
shizishanshang(金币+3): 是基因家族，全长已经得到，当时测序的克隆少了，多的话可能不止4个，不过这已经够我头晕的了，不知道怎么设计引物做定量PCR了 2011-10-04 15:17:00
引用回帖:
Originally posted by shizishanshang at 2011-07-05 17:19:12:
我是在NCBI上BLAST的了，通过BLASTN或者BLASTX都与已知的基因同源性比较高。我是用BLAST的里面的两两比较确定其相似性的。比如
Score =  663 bits (734),  Expect = 0.0
Identities = 705/936 (75%), Gaps  ...

这个应该是基因家族了,不像是剪切.你可以把你同一对引物克隆的序列做个比对看看。
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7楼2011-07-06 09:28:32
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thinka

铜虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
shizishanshang(金币+1):谢谢参与
silicare(金币+3, EPI+1): 前提是PCR没有突变 2011-07-05 12:12:51
shizishanshang(金币+2): 谢谢啊，看着BLAST结果头晕着呢 2011-07-05 17:22:40
肯定不是测序的问题。对于植物来说最大的可能是因为大的基因家族,也有可能是选择性剪切.不知道你说得相似性是怎么算出来的,是SNP还是有插入或者确实的片段？做过blast没有呢，可以试一下用clustalx或者seqman等比一下看看。

怎么能一一对应基因组DNA呢？这句话没看明白你是什么意思，你是问如何去对应还是已经对应了你不理解为什么？

你可以通过比对基因组序列和mRNA序列来分析你这些序列所对应的基因组的结构的，这个可以帮助你确定他们是基因家族还是选剪以及是如何剪切的。植物的基因组有多倍体。

另外还有个问题，不知道的模板是DNA还是cDNA.
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2楼2011-07-05 10:39:32
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magy2006

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
shizishanshang(金币+1):谢谢参与
silicare(金币+3, EPI+1): 有一定道理 2011-07-05 12:13:39
shizishanshang(金币+1): 恩，问了一下公司说测序肯定没有问题，我的片段大约850bp，测通的 2011-07-05 17:23:19
shizishanshang(金币+2): 已经证明是基因家族，全长已经得到，既是做荧光定量不好设计引物了 2011-10-04 15:15:03
测序对结果也是有较大影响的，并非楼上说的肯定不是测序的问题。
一般的测序仪在600以内保证没问题，800左右及以上就不准确了，尤其是技术不过关的企业。
你通过兼并引物扩出来的片段我感觉更多的像是基因家族的多个成员，毕竟他们有着相似度很高的保守区段，当然也不排除其他的可能……
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3楼2011-07-05 10:45:59
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thinka

铜虫 (著名写手)
楼上，有谁会在截取结果的时候要那些不确定的部分呢。肯定是要结果好的地方啊。
我们实验室是自己测序的，都是用chromas自己分析测序结果的。

[ Last edited by thinka on 2011-7-6 at 09:44 ]
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4楼2011-07-05 10:50:48
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