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shizishanshang

至尊木虫 (职业作家)

[交流] 测序结果的疑问

前面利用CODEHOPE设计了简并引物，克隆一个基因片段。现在测序结果已经出来，令我很疑惑。

割胶回收后连接PMD18载体后，涂平板，挑单菌过夜摇菌，之后提质粒酶切，送去测序。

现在问题来了，同一个平板出来的克隆，测序结果不同，有80%左右的相似性。BLAST后都与相关基因具有比较高的同源性。

现在一共送去了11个克隆测序，目前粗粗看了一下至少有4个不同的片段，之间一般是具有80%左右的同源性。

请问这是怎么回事？基因家族？我要克隆的这个基因是具有基因家族的传统的，拟南芥等植物里一般有4-8个基因家族是很正常的。 还是测序问题？

令外问一个令我不解的问题，植物的基因组应该是固定的吧，那么那么多基因家族，对应的外显子应该不同，怎么能一一对应基因组DNA呢？

望大家解惑，谢谢！
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1楼 2011-07-05 09:49:13
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magy2006

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
shizishanshang(金币+1):谢谢参与
silicare(金币+3, EPI+1): 有一定道理 2011-07-05 12:13:39
shizishanshang(金币+1): 恩，问了一下公司说测序肯定没有问题，我的片段大约850bp，测通的 2011-07-05 17:23:19
shizishanshang(金币+2): 已经证明是基因家族，全长已经得到，既是做荧光定量不好设计引物了 2011-10-04 15:15:03
测序对结果也是有较大影响的，并非楼上说的肯定不是测序的问题。
一般的测序仪在600以内保证没问题，800左右及以上就不准确了，尤其是技术不过关的企业。
你通过兼并引物扩出来的片段我感觉更多的像是基因家族的多个成员，毕竟他们有着相似度很高的保守区段，当然也不排除其他的可能……
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3楼2011-07-05 10:45:59
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thinka

铜虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
shizishanshang(金币+1):谢谢参与
silicare(金币+3, EPI+1): 前提是PCR没有突变 2011-07-05 12:12:51
shizishanshang(金币+2): 谢谢啊，看着BLAST结果头晕着呢 2011-07-05 17:22:40
肯定不是测序的问题。对于植物来说最大的可能是因为大的基因家族,也有可能是选择性剪切.不知道你说得相似性是怎么算出来的,是SNP还是有插入或者确实的片段？做过blast没有呢，可以试一下用clustalx或者seqman等比一下看看。

怎么能一一对应基因组DNA呢？这句话没看明白你是什么意思，你是问如何去对应还是已经对应了你不理解为什么？

你可以通过比对基因组序列和mRNA序列来分析你这些序列所对应的基因组的结构的，这个可以帮助你确定他们是基因家族还是选剪以及是如何剪切的。植物的基因组有多倍体。

另外还有个问题，不知道的模板是DNA还是cDNA.
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2楼2011-07-05 10:39:32
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thinka

铜虫 (著名写手)
楼上，有谁会在截取结果的时候要那些不确定的部分呢。肯定是要结果好的地方啊。
我们实验室是自己测序的，都是用chromas自己分析测序结果的。

[ Last edited by thinka on 2011-7-6 at 09:44 ]
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4楼2011-07-05 10:50:48
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shizishanshang

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by thinka at 2011-07-05 10:39:32:
肯定不是测序的问题。对于植物来说最大的可能是因为大的基因家族,也有可能是选择性剪切.不知道你说得相似性是怎么算出来的,是SNP还是有插入或者确实的片段？做过blast没有呢，可以试一下用clustalx或者seqman等比 ...

我是在NCBI上BLAST的了，通过BLASTN或者BLASTX都与已知的基因同源性比较高。我是用BLAST的里面的两两比较确定其相似性的。比如
Score =  663 bits (734),  Expect = 0.0
Identities = 705/936 (75%), Gaps = 23/936 (2%)
Strand=Plus/Plus

Query  1    GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGGAGTACAAGCAAATCCAAAAGT  60
            ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  23   GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGGAGTACAAGCAAATCCAAAAGT  82

Query  61   AATGAACTGGTGAATGAGCATTAAGATGACGGCAGTGTCACGCCAGCCAGTCCTGGAGAG  120
            ||| ||||| ||||| ||||| |  ||||| ||| | || |   | ||||| || | |||
Sbjct  83   AATAAACTGATGAATAAGCATGAGTATGACAGCACTATCTCTGAATCCAGTTCTTGGGAG  142

Query  121  AAGTGAGAAGGCGTTGGAATGATTGAGGAGTTGATCGCCGAATGCCCAGTAGACGGCGGT  180
             | |||||| || |||| |||  | || ||    || || |||||||| || || || |
Sbjct  143  CAATGAGAAAGCATTGGCATGGGTAAGAAGCATGTCTCCAAATGCCCAATACACAGCAGA  202

Query  181  GGCTGAGGGAATTGTTAATGTGAAAACGTACAAGGTAGCAAACAGATATATGTACTTGAA  240
             || || || |  || || || || || || |  || || | ||  |||||   ||||||
Sbjct  203  AGCCGATGGCAAAGTCAAGGTTAATACATAAAGTGTCGCCATCAAGTATATCACCTTGAA  262

Query  241  CTTTTGAGGTTTCCACATGGCGTGCATAATCTCCACAGTAACAGCGTGGCCACCAAAAGT  300
            ||| || || |||||||| || ||||| ||||| || || ||||| || || ||||| ||
Sbjct  263  CTTCTGTGGCTTCCACATTGCATGCATGATCTCAACTGTGACAGCATGTCCCCCAAACGT  322

Query  301  GTACAGAATATTGGTAGCGCCAGTGAAGTACAGCACTAGCTTTGTCGGAGCCGAGTGTGA  360
            ||| ||||| || ||||| ||||||||||| || || |  || || ||  |||||||   
Sbjct  323  GTAGAGAATGTTAGTAGCTCCAGTGAAGTAGAGAACCATTTTAGTTGGGCCCGAGTGCTT  382

Query  361  CACACCTTCAACCTGGCCATGTACAAGGGCGGCAATGGCCATATACCAGGCGGTGTAAGT  420
            ||| ||||||||||| ||||| |  ||||  || ||||  | |||||| || || |||||
Sbjct  383  CACTCCTTCAACCTGTCCATGAATTAGGGAAGCTATGGTTAAATACCATGCAGTATAAGT  442

Query  421  GGTCATGCCGAGGCCGAGAAAAGACCAGATTCGGTAGTTATGAAAGGAAGGGATGAACAC  480
             |||||    ||||| | ||| ||||| |||| ||||||||| || || || || |||||
Sbjct  443  AGTCATCATAAGGCCAACAAATGACCAAATTCTGTAGTTATGGAATGAGGGAATAAACAC  502
或者，另外的对比后，
Score =  746 bits (826),  Expect = 0.0
Identities = 722/928 (78%), Gaps = 0/928 (0%)
Strand=Plus/Plus

Query  1    AGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGGAGTACAAGCAAATCCAAAAGTAATGAAC  60
            ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2    AGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTGGAGTACAAGCAAATCCAAAAGTAATGAAC  61

Query  61   TGGTGAATGAGCATTAAGATGACGGCAGTGTCACGCCAGCCAGTCCTGGAGAGAAGTGAG  120
            || || ||||||||||| | ||| ||  |||| ||  ||   |   ||| || ||| |  
Sbjct  62   TGATGGATGAGCATTAAAACGACAGCCATGTCTCGGAAGGGTGATTTGGGGAAAAGGGCA  121

Query  121  AAGGCGTTGGAATGATTGAGGAGTTGATCGCCGAATGCCCAGTAGACGGCGGTGGCTGAG  180
            || |||||||| ||||| || ||    || || |||||||| ||||| || |  || |||
Sbjct  122  AAAGCGTTGGAGTGATTAAGAAGCATGTCCCCAAATGCCCAATAGACAGCTGATGCCGAG  181

Query  181  GGAATTGTTAATGTGAAAACGTACAAGGTAGCAAACAGATATATGTACTTGAACTTTTGA  240
            || | ||| | ||| ||||| || |  || || |  |  ||||||  ||||||||||||
Sbjct  182  GGCAGTGTCAGTGTCAAAACATAGAGAGTCGCCAGTAAGTATATGGCCTTGAACTTTTGG  241

Query  241  GGTTTCCACATGGCGTGCATAATCTCCACAGTAACAGCGTGGCCACCAAAAGTGTACAGA  300
            || |||||||| || ||||| || |||||||||||||| || || ||||| ||||| |||
Sbjct  242  GGCTTCCACATAGCATGCATTATTTCCACAGTAACAGCATGTCCTCCAAATGTGTAGAGA  301

Query  301  ATATTGGTAGCGCCAGTGAAGTACAGCACTAGCTTTGTCGGAGCCGAGTGTGACACACCT  360
            || || || || || || || || | ||  ||||| || ||  | || |||  ||| |||
Sbjct  302  ATGTTTGTGGCTCCTGTAAAATATAACATCAGCTTGGTTGGGCCTGAATGTTTCACTCCT  361

Query  361  TCAACCTGGCCATGTACAAGGGCGGCAATGGCCATATACCAGGCGGTGTAAGTGGTCATG  420
            || ||||||||||| |  || || |||||||  | |||||| |  |||||||| |||||
Sbjct  362  TCCACCTGGCCATGGAGGAGAGCAGCAATGGTGAGATACCAAGACGTGTAAGTTGTCATC  421

Query  421  CCGAGGCCGAGAAAAGACCAGATTCGGTAGTTATGAAAGGAAGGGATGAACACAGTGGTG  480
             ||||||| ||||||||||| |||| |||||| ||||| ||||| ||||| || || ||
Sbjct  422  ACGAGGCCAAGAAAAGACCAAATTCTGTAGTTGTGAAATGAAGGAATGAAGACTGTAGTT  481

Query  481  GCACAGCAAGCACCAAAAATATAAGTCCATGTTCGCTTATCCAATCGGTCGTTGATGTAG  540
            ||||||||||| || || || |||||||| || | ||| ||||    ||| || |||||
--------------------
不能上传图片，排列的很不齐啊。

我是用CDNA作模板的，还么有用DNA作模板扩。
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5楼2011-07-05 17:19:12
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