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jinglilv

禁虫 (小有名气)
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1楼 2011-07-04 14:50:28
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wulishu

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): 热心 2011-07-04 18:01:41
1。检查提取RNA是否有降解，吸光度和电泳图都要看，而且吸光度一定要达到要求，另外你在溶解RNA的时候是否有酒精残留（残留有可能会影响你后续实验）
2。反应体系要按照说明书配制，建议不要自己修改（酶和其他试剂的量），还要注意例如dNTP的浓度与说明书里让加入的是否一致，如果有条件的话建议你用公司事先预混好的酶
3。退火温度过高或过低也有可能得不到目的条带，参照Tm值做一下梯度试试

我遇到过和你差不多的情况，仅供参考
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4楼2011-07-04 16:41:26
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喇叭

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
jinglilv(金币+2): 谢谢 2011-07-04 17:16:12
dhd997(金币+3): good 2011-07-04 18:01:09
应该是反转录的时候就没有cDNA,最大的可能性是提取RNA时RNA被降解了，我以前也出现过这种情况，重新提取RNA再做，每一步都小心一点，一帮都没有问题，还有就是你的cDNA有没有对照试验，例如actin
加油吧，做分子的就是这样
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2楼2011-07-04 15:00:01
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beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-07-04 18:01:29
质粒上的基因在肿瘤细胞里表达了没有呢？是否先要检测一下所表达的蛋白啊，如果没有被表达，是不是就得不到相应的cDNA啊？在做PCR就没有产物了呢？我没有做过这，猜测一下的。
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3楼2011-07-04 16:03:19
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雨城雨

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-07-04 18:01:50
1.重新提RNA反转录。
2.以cDNA为模板扩增25-30个循环，以产物为模板二次PCR
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5楼2011-07-04 16:56:08
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jinglilv

禁虫 (小有名气)
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6楼2011-07-04 17:15:54
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jinglilv

禁虫 (小有名气)
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7楼2011-07-04 17:18:02
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喇叭

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by jinglilv at 2011-07-04 17:15:54:
当时提出来RNA做了一个电泳，在最下面是有降解条带，但不至于把mRNA给降解完吧。
另外，我没有做过对照实验，麻烦你详细说一下好吗？
非常感谢你的帮助。

对照试验是为了证明自己的cDNA没问题，我做的是丝状真菌的RT-PCR，每种菌都有自己的家族蛋白，如果cDNA好的话，该家族蛋白就会表达，主要是为了验证反转录是否成功
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8楼2011-07-05 10:20:29
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wulishu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by jinglilv at 2011-07-04 17:18:02:
提RNA最后一步洗涤的时候我用75%的DEPC水配制的酒精洗了两次。因为洗一次的话会260/230值偏低。是不是和这有关系呢？
非常感谢你的帮助。

没什么关系，无论洗多少次只要最后晾干再加水溶解就可以，但是如果RNA降解的话就不好说了，不一定要都降解完，如果恰好你要PCR的那些降解掉了那么你就P不出来了，所以说一定要保证RNA质量，否则你都不知道问题出在什么地方了
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9楼2011-07-06 10:12:47
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hijackwu
10楼2012-03-21 16:34:02
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