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2008116068木虫 (著名写手)
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[求助]
PCR扩增出现的问题
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我从一个8K质粒上扩增一段2.8K的目的片段，无论自己设计引物（16到22个碱基）还是按文献提供的引物（35和38个碱基），均扩增不出来。已经花了一个月的时间了，如果再扩增不出来，下个月就要换课题了。 目的片度的特点是GC含量约30%。 各位虫友，有什么好的建议吗？对我来说很重要，就麻烦大家了。 谢谢  |
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好吧，这么说吧： 1。确保你的模板没有任何问题，质粒用试剂盒重新抽提。 2.你要扩增的片段是从640-3490，AT含量较高，引物不好设计，你应该考试试专门针对AT-rich的扩增方法。 3.如果还是不行的话，建议你不要再纠结于引物扩增，而改用酶切回收，看了一下酶切位点还是有很多可以选择的，提供两个和你两端比较接近的 5‘端： BamHI 2 G/GATCC 635 5578 3'端：SwaI 2 ATTT/AAAT 3470 6123 直接回收635-3470片段大小的， 后面看你想干嘛了，用Taq酶补平加A尾进行TA克隆；或者再用你的引物PCR试试，应该没有什么太麻烦的二级结构了 都试试吧 |
9楼2011-06-18 16:08:37
天使托
专家顾问 (职业作家)
T.Shen
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2楼2011-06-14 17:48:11
3楼2011-06-14 18:41:43
2008116068
木虫 (著名写手)
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- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
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目标序列为 CTAACTTATAGGGGTAACACTTAAAAAAGAATCAATAACGATAGAAACCGCTCCTAAAGCAGGTGCATTTTTTCCTAACGAAGAAGGCAATAGTTCACATTTATTGTCTAAATGAGAATGGACTCTAGAAGAAACTTCGTTTTTAATCGTATTTAAAACAATGGGATGAGATTCAATTATATGATTTCTCAAGATAACAGCTTCTATATCAAATGTATTAAGGATATTGGTTAATCCAATTCCGATATAAAAGCCAAAGTTTTGAAGTGCATTTAACATTTCTACATCATTTTTATTTGCGCGTTCCACAATCTCTTTTCGAGAAATATTCTTTTCTTCTTTAGAGAGCGAAGCCAGTAACGCTTTTTCAGAAGCATATAATTCCCAACAGCCTCGATTTCCACAGCTGCATTTGGGTCCATTAAAATCTATCGTCATATGACCCATTTCCCCAGAAAAACCCTGAACACCTTTATACAATTCGTTGTTAATAACAAGTCCAGTTCCAATTCCGATATTAATACTGATGTAAACGATGTTTTCATAGTTTTTTGTCATACCAAATACTTTTTCACCGTATGCTCCTGCATTAGCTTCATTTTCAACAAAAACCGGAACATTAAACTCACTCTCAATTAAAAACTGCAAATCTTTGATATTCCAATTTAAGTTAGGCATGAAAATAATTTGCTGATGACGATCTACAAGGCCTGGAACACAAATTCCTATTCCGACTAGACCATAAGGGGACTCAGGCATATGGGTTACAAAACCATGAATAAGTGCAAATAAAATCTCTTTTACTTCACTAGCGGAAGAACTAGACAAGTCAGAAGTCTTCTCGAGAATAATATTTCCTTCTAAGTCGGTTAGAATTCCGTTAAGATAGTCGACTCCTATATCAATACCAATCGAGTAGCCTGCATTCTTATTAAAAACAAGCATTACAGGTCTTCTGCCGCCTCTAGATTGCCCTGCCCCAATTTCAAAAATAAAATCTTTTTCAAGCAGTGTATTTACTTGAGAGGAGACAGTAGACTTGTTTAATCCTGTAATCTCAGAGAGAGTTGCCCTGGAGACAGGGGAGTTCTTCAAAATTTCATCTAATATTAATTTTTGATTCATTTTTTTTACTAAAGCTTGATCTGCAATTTGAATAATAACCACTCCTTTGTTTATCCACCGAACTAAGTTGGTGTTTTTTGAAGCTTGAATTAGATATTTAAAAGTATCATATCTAATATTATAACTAAATTTTCTAAAAAAAACATTGAAATAAACATTTATTTTGTATATGATGAGATAAAGTTAGTTTATTGGATAAACAAACTAACTCAATTAAGATAGTTGATGGATAAACTTGTTCACTTAAATCAAAGGGGGAAATGACAAATGGTCCAAACTAGTGATATCTAAAAATCAAAGGGGGAAATGAGATCTATGGTAAGCCGATACGTACCCGATATGGGCGATCTGATTTGGGTTGATTTTGACCCGACAAAAGGTAGCGAGCAAGCTGGACATCGTCCAGCTGTTGTCCTGAGTCCTTTCATGTACAACAACAAAACAGGTATGTGTCTGTGTGTTCCTTGTACAACGCAATCAAAAGGATATCCGTTCGAAGTTGTTTTATCCGGTCAGGAACGTGATGGCGTAGCGTTAGCTGATCAGGTAAAAAGTATCGCCTGGCGGGCAAGAGGAGCAACGAAGAAAGGAACAGTTGCCCCAGAGGAATTACAACTCATTAAAGCCAAAATTAACGTACTGATTGGGTAGGCATGCTAATGCGGCCGCGAATTCCTGCAGCCCTGGCGAATGGCGATTTTCGTTCGTGAATACATGTTATAATAACTATAACTAATAACGTAACGTGACTGGCAAGAGATATTTTTAAAACAATGAATAGGTTTACACTTACTTTAGTTTTATGGAAATGAAAGATCATATCATATATAATCTAGAATAAAATTAACTAAAATAATTATTATCTAGATAAAAAATTTAGAAGCCAATGAAATCTATAAATAAACTAAATTAAGTTTATTTAATTAACAACTATGGATATAAAATAGGTACTAATCAAAATAGTGAGGAGGATATATTTGAATACATACGAACAAATTAATAAAGTGAAAAAAATACTTCGGAAACATTTAAAAAATAACCTTATTGGTACTTACATGTTTGGATCAGGAGTTGAGAGTGGACTAAAACCAAATAGTGATCTTGACTTTTTAGTCGTCGTATCTGAACCATTGACAGATCAAAGTAAAGAAATACTTATACAAAAAATTAGACCTATTTCAAAAAAAATAGGAGATAAAAGCAACTTACGATATATTGAATTAACAATTATTATTCAGCAAGAAATGGTACCGTGGAATCATCCTCCCAAACAAGAATTTATTTATGGAGAATGGTTACAAGAGCTTTATGAACAAGGATACATTCCTCAGAAGGAATTAAATTCAGATTTAACCATAATGCTTTACCAAGCAAAACGAAAAAATAAAAGAATATACGGAAATTATGACTTAGAGGAATTACTACCTGATATTCCATTTTCTGATGTGAGAAGAGCCATTATGGATTCGTCAGAGGAATTAATAGATAATTATCAGGATGATGAAACCAACTCTATATTAACTTTATGCCGTATGATTTTAACTATGGACACGGGTAAAATCATACCAAAAGATATTGCGGGAAATGCAGTGGCTGAATCTTCTCCATTAGAACATAGGGAGAGAATTTTGTTAGCAGTTCGTAGTTATCTTGGAGAGAATATTGAATGGACTAATGAAAATGTAAATTTAACTATAAACTATTTAAATAACAGATTAAAAAAATTATAAAAAAATTGAAAAAATGGTGGAAACACTTTTTTCAATTTTTTTGTTTTATTATTTAATATTTGGGAAATATTCATTCTAATTGGTAATCAGATTTTAGAAAACAATAAACCCTTGCATAGGGGGATCTCG |
4楼2011-06-14 22:44:11