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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 用分光计怎么样测酶活?
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yunhaoxu001

金虫 (小有名气)

[交流] 用分光计怎么样测酶活? 已有5人参与

     我在试验中测脂肪酶的活性，开始用滴定法测定，但出现酶活为负的结果，所以寻求用分光计发测没货的方法或者其他的方法能够准确的测定酶活。
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1楼 2011-05-17 15:07:21
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newtime007

木虫 (正式写手)

成长的微生物
★ ★ ★ ★ ★ ★
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wolfebst(金币+5, EPI+1): 鼓励一下 2011-05-17 15:56:31
所谓的分光计发测酶活是一种间接方法，首先寻找到具有紫外可见光吸收的底物，然后用标准曲线法换算酶活（如酪蛋白酶）。所以你需要找到能有紫外可见光吸收之底物，估计脂肪类没有，因此你还是滴定检测吧。另外可试试下边的
原理：用酸价作指标， 用95%乙醇作终止剂， 通过酸价的测定反映脂肪酶分解脂肪的程度， 从而求得酶活力。

方法：

1、粗酶液的制备

用电子天平分别称取粗脂肪酶0.010 g、0.020 g 和0.030 g， 用蒸馏水溶解并定容至100 mL， 配成浓度分别为0.01%、0.02% 和0.03%的粗酶液。

2、酸价的测定

酸价是指中和1 mol游离脂肪酸所需NaOH的毫克数， 它用于衡量油脂的水解程度。实验中用酸碱滴定法测定水解液的酸价， 参照文献[ 3， 4 ]中所使用的方法， 向所得的水解液滴加1 mL 95%的乙醇溶液， 摇匀， 终止反应， 并加入2滴酚酞指示剂， 迅速用0.05 mol/L的NaOH溶液滴定至溶液呈微红色， 在30 s内不消失为终点， 记录消耗的NaOH溶液毫升数(V ) 。用同样的方法测定空白值， 每个试验重复两次， 以平均值作为测定结果。

酸价按下式计算：
X = C (V - V0 ) ×40 /M
式中: X —油脂酸价(mgNaOH /g油)
C—NaOH标准溶液的浓度(mol/L)
M —试样的质量( g)
40—NaOH的mmol质量(mg/mmol)

3粗脂肪酶活力的测定

在最佳水解条件下， 分别测得粗脂肪酶和标准脂肪酶水解液的酸价X1、X2 ， 根据公式U1 /U= X1 / X2求得粗脂肪酶的活力， 其中U1为粗脂肪酶活力， U为标准脂肪酶活力。
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上善若水，水善利万物而不争
3楼2011-05-17 15:37:41
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802311820

金虫 (小有名气)
★ ★
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wolfebst(金币+1): 鼓励新虫 2011-05-17 15:56:54
同问用分光光度计法测酶活
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2楼2011-05-17 15:18:16
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★
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滴定法是分析化学范畴，可以做到分析纯的鉴定。分光光度法要产生可见光的差别才能看得出来，灵敏度比滴定法差得多。既然测定酶活力的时候出现负值，就表示酶活力太低根本测定不出来，这样的情况我的实验出现过多次了，即使用分光光度计也是徒劳，我用进口的酶标仪也是测定不出来的，楼主别想着用更加落后的分光光度计了。

别想着什么操作步骤，趁早设计课题，会节省更多时间。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
4楼2011-05-17 16:16:58
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★
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引用回帖:
Originally posted by newtime007 at 2011-05-17 15:37:41:
所谓的分光计发测酶活是一种间接方法，首先寻找到具有紫外可见光吸收的底物，然后用标准曲线法换算酶活（如酪蛋白酶）。所以你需要找到能有紫外可见光吸收之底物，估计脂肪类没有，因此你还是滴定检测吧。另外可试 ...

你这个实质上还是滴定法
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
5楼2011-05-17 16:19:14
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